L05063赖晔-结题论文

几种有机溶剂中木瓜蛋白酶的动力学研究2002级生技1班 赖 晔 指导教师 何 平 （生命科学学院）1、前言在二十世纪六十年代Dastoli等人就发现了几种酶在有机溶剂中仍具有活性，但并未引起人们的重视。自1984年Zaks和Klibanov报道了脂肪酶在有机溶剂中具有极高的热稳定性和较高的催化活性以来，酶在有机溶剂中的催化活性才逐渐受到人们的重视。研究表明，许多酶不但在有机介质中具有活性，而且与在水溶液相比，酶在有机溶剂中的催化反应具有许多潜在优势：不易溶于水的底物在有机溶剂中可能会有良好的溶解性，因此可以取得高效催化；在有机溶剂中底物发生的副反应及产物抑制会大大减少；酶的热稳定性增强；因为大多数酶不溶于有机溶剂因此常常不需固定化，若需固定化时，由于在非水介质中酶不能从吸附表面解吸附，因此酶在非孔表面的吸附效果就很好；微生物在有机溶剂中很难存活，因此没有微生物污染；酶的回收与再利用也更简单方便；在有机溶剂中酶可以改变反应的平衡点，使反应向所需的方向移动，如：在有机溶剂中用蛋白酶合成二肽；脂肪酶在有机溶剂中催化脂的合成或酰基转移；可以减少由水引起的副反应；有机介质可以改变酶的选择性，在有机合成中具有极高的应用价值。 本实验的研究重点是以木瓜蛋白酶为代表，以几种有机溶剂作为介质来研究酶的活性变化。2材料与方法2.1实验材料与试剂木瓜蛋白酶纯酶和酪蛋白为Sigma公司产品；尼龙布(100目)；壳聚糖（脱乙酰度90）；其它试剂为国产分析纯。2.2 溶液配制(1) 0.1mol/L pH 7.2的磷酸缓冲液；(2) 0.1mol/L pH 7.2 Tris-盐酸缓冲液；(3) 1g/L PA液：用pH 7.2的磷酸缓冲液配制；(4) 激活剂：36mmol/L半胱氨酸，0.6mmol/L EDTA，溶于0.1mol/L pH 7.2磷酸或Tris-盐酸缓冲液中；(5) 10g/L或15g/L酪蛋白溶液：用0.1mol/L pH 7.2磷酸或Tris-盐酸缓冲液配制；(6) 200g/L三氯乙酸溶液。2.3 实验设备SHA-B型恒温振荡器，JJ-1精密电动搅拌器，HWS24型电热恒温水浴锅，752紫外光栅分光光度计，PHSJ-4A精密pH计，AB204-N万分之一精密电子天平。2.4 实验方法2.4.1在海藻酸钠壳聚糖固定化木瓜蛋白酶（immobilized papain on sodium alginate - chitosan ,IPSAC）的制备IPSAC制备所述的方法进行。称取2g海藻酸钠溶于100mL pH 7.2 0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液中，再加入1g壳聚糖粉末，微波炉加热至80左右并搅拌均匀,冷却至40左右，加入PA，搅拌。将此混合液缓慢滴入0.5mol/L氯化钙溶液中形成小球，置于冰箱4下30min。使用前用蒸馏水洗涤3次，用粗滤纸吸干。2.4.2 有机溶剂中PA动力学的测定方法PA动力学测定采用酪蛋白为底物进行。取0.1mL(1g/L)酶液，加入0.25mL激活剂和2.4mL有机溶液（浓度分别为0%、5%、10%、20%、50%；溶于pH7.2 0.1mol/L磷酸缓冲液），于37oC下预热10min，加入37oC预热的15g/L酪蛋白溶液分别为0.045 mL、0.065 mL、0.085 mL、0.125 mL、0.25 mL、0.5mL（少于0.5 mL用pH7.2 、0.1mol/L磷酸缓冲液补齐），准确反应10min，然后加入1.0mL 200g/L三氯乙酸溶液终止酶反应。对照管先加入200g/L三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。过滤，取其上清液于波长275nm处测定消光值。2.4.3有机溶剂中IPSAC动力学的测定方法取IPSAC 1g，加入0.25mL激活剂和2.5mL有机溶液（浓度分别为0%、5%、10%、20%、50%；溶于pH7.2 0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液），于37oC下预热10min，加入37oC预热的15g/L酪蛋白溶液分别为0.035 mL、0.065 mL、0.125 mL、0.25 mL、0.5mL（少于0.5 mL用pH7.2 0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液补齐），准确反应10min，然后加入1.0mL 200g/L三氯乙酸溶液终止酶反应。对照管先加入200g/L三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。过滤，取其上清液于波长275nm处测定消光值。3 结果与分析3.1有机溶剂中PA的动力学曲线3.1.1不同浓度二甲基亚砜中PA的动力学曲线采用Lineweaver-Burk作图法(如图3.1.1)计算，在0、5、10、20二甲基亚砜溶液中，PA的米氏常数（Km）分别为9.59 mg/mL、14.16mg/mL、17.39mg/mL、14.38mg/mL，最大反应速度（Vmax）分别为101.01 gTyr/ mLmin、147.06gTyr/ mLmin、185.19gTyr/ mLmin、144.93gTyr/ mLmin。在5、10、20二甲基亚砜中，Km值分别为0二甲基亚砜中的147.74、181.40、149.98，酶对底物分子的亲和力减小； Vmax值分别为0二甲基亚砜中的145.59、183.33、143.48。可见，在此范围内，二甲基亚砜浓度升高，最大反应速度也上升。图3.1.1不同浓度二甲基亚砜中PA的动力学曲线Fig.3.1.1 The kinetics curve of PA in different concentrations of dimethyl sulfoxide 3.1.2不同浓度二氧六环中PA的动力学曲线采用Lineweaver-Burk作图法(如图3.1.2)计算，在0、5、10、20二氧六环溶液中，PA的Km分别为9.59 mg/mL 、12.85mg/mL、15.48mg/mL、9.73mg/mL，Vmax分别为101.01 gTyr/ mLmin、133.33gTyr/ mLmin、163.93gTyr/ mLmin、70.42gTyr/ mLmin。在5、10、20二氧六环中，Km值分别为0二氧六环中的134.09、161.44、101.46，酶对底物分子的亲和力减小； Vmax值分别为0二氧六环中的132.00、162.32、69.72。可见，在一定浓度的二氧六环中最大反应速度上升，而二氧六环超过一定浓度，最大反应速度下降。图3.1.2不同浓度二氧六环中PA的动力学曲线Fig.3.1.2 The kinetics curve of PA in different concentrations of dioxane 3.1.3不同浓度甲醇中PA的动力学曲线采用Lineweaver-Burk作图法(如图3.1.3)计算，在0、5、10、20、50甲醇溶液中，PA的Km分别为9.59 mg/mL 、10.01mg/mL、9.32mg/mL、8.51mg/mL、6.97mg/mL，Vmax分别为101.01 gTyr/ mLmin、104.17gTyr/ mLmin、99.01gTyr/ mLmin、87.72gTyr/ mLmin、48.78gTyr/ mLmin。在5、10、20、50甲醇中， Km值分别为0甲醇中的104.43、97.19、88.76、72.72，Km值下降，表明在甲醇浓度升高时，酶对底物的亲和力上升；但此时Vmax值分别为0甲醇中的103.13、98.02、86.84、48.29，处于下降的趋势，因而酶活性表现下降。图3.1.3 不同浓度甲醇中PA的动力学曲线Fig.3.1.3 The kinetics curve of PA in different concentrations of methanol 3.2 有机溶剂中IPSAC的动力学曲线3.2.1不同浓度二甲基亚砜中IPSAC的动力学曲线采用Lineweaver-Burk作图法(如图3.2.1)计算，在0、5、10、20二甲基亚砜溶液中，IPSAC的Km分别为11.20mg/mL 、10.37mg/mL、9.87mg/mL、10.57mg/mL。在5、10、20二甲基亚砜中， Km值分别为0二甲基亚砜中的92.53、88.09、94.34，表现出下降的趋势；而Vmax分别为77.52gTyr/ mLmin、79.37gTyr/ mLmin、82.64gTyr/ mLmin、70.92gTyr/ mLmin。Vmax值分别为0二甲基亚砜中的102.38、106.61、91.49，说明在低浓度的二甲基亚砜中酶的最大催化反应速度有上升的趋势。图3.2.1不同浓度二甲基亚砜中IPSAC的动力学曲线Fig.3.2.1 The kinetics curve of IPSAC in different concentrations of dimethyl sulfoxide 3.2.2不同浓度二氧六环中IPSAC的动力学曲线采用Lineweaver-Burk作图法(如图3.2.2)计算，在0、5、10、20二氧六环溶液中，IPSAC的Km分别为11.20mg/mL 、11.34mg/mL、11.30mg/mL、11.22mg/mL，在5、10、20二氧六环中， Km值分别为0二氧六环中的101.23、100.90、100.17；而V max分别为77.52gTyr/ mLmin、86.96gTyr/ mLmin、94.34gTyr/ mLmin、78.74gTyr/ mLmin。在5、10、20二氧六环中Vmax值分别为0二氧六环中的112.17、121.70、101.57，表现上升的趋势。图3.2.2不同浓度二氧六环中IPSAC的动力学曲线Fig.3.2.2 The kinetics curve of IPSAC in different concentrations of dioxane 3.2.3不同浓度甲醇中IPSAC的动力学曲线采用Lineweaver-Burk作图法(如图3.2.3)计算，在0、5、10、20甲醇溶液中，IPSAC的Km分别为11.20mg/mL 、11.57mg/mL、11.23mg/mL、11.33mg/mL，。在5、10、20甲醇中， Km值分别为0甲醇中的103.27、100.27、101.16。而Vmax分别为77.52gTyr/ mLmin、80.00gTyr/ mLmin、74.63gTyr/ mLmin、71.94gTyr/ mLmin。在5、10、20甲醇中， Vmax值分别为0甲醇中的103.20、96.27、92.81。可见，在不同浓度的甲醇溶液中，酶的最大反应速度有下降的趋势。图3.2.3不同浓度甲醇中IPSAC的动力学曲线Fig.3.2.3 The kinetics curve of IPSAC in different concentrations of methanol 4小结PA、IPSAC在缓冲液中的Km分别为9.59mg/mL、11.20mg/mL； Vmax分别为101.01gTyr/ mLmin、77.52gTyr/ mLmin。4.1 有机溶剂中PA的动力学二甲基亚砜、二氧六环、乙腈，随着浓度的升高，酶的Km先升后降。这可能在有机溶剂低浓度时，酶的三维结构发生的变化，不利于底物与酶的结合部位的结合，但随着有机溶剂浓度的进一步提高，酶的三维结构发生更大的变化，提高了底物与酶的结合部位的结合能力。这三种有机溶剂的疏水参数（logP）较低，分别为1.30，1.10，0.33。在二甲基亚砜、二氧六环、乙腈有机溶剂中，随着浓度的升高，Vmax先升后降并且升的值超过在磷酸缓冲液中的Vmax，后来下降也很缓慢。4.2 有机溶剂中IPA的动力学曲线 IPSAC，在二甲基亚砜、乙腈有机溶剂中，随着浓度的升高，Km有少许下降。在二氧六环中，Km随浓度变化小，且不规律。 IPSAC在有机溶剂中Vmax变化规律与PA中的基本一致。参考文献1 赵元藩、丁认全. 1999. 木瓜蛋白酶的加工工艺及应用. 云南师范大