微生物的遗传变异.doc

第八章 微生物的遗传变异教学目的及要求：通过本章的学习使学生了解证明DNA是遗传物质的三个经典实验；掌握微生物遗传育种的方法；菌种衰退、复壮和菌种保藏的方法；了解基因工程的基本操作步骤及未来的前景。重点及难点：难点是微生物基因重组的方法教学方法：采用教师主讲的方法教学效果追记：遗传（Heredity或Inheritance）和变异（Variation）是生物的基本特征之一，在讨论遗传变异时，常提到如下几个概念：（1） 遗传型（Genotype）又称基因型它是指某一生物个体所含有的全部遗传因子的总和。遗传物质起决定性作用，而外界环境可以影响其表型，即： 遗传型+环境条件=表型（2） 表型：指肉眼可以观察到的某一生物所有具有的一切外部特征。（3） 变异：指生物体在内因或外因的作用下引起的遗传物质的改变。第一节 遗传变异的物质基础现代人都知道生物的遗传物质是DNA，但过去曾有过种种争论和推测，后来通过三个实验才以确凿的证据证实了这一点：一、 三个经典实验：（一） 转化实验：1928年英国的细菌学家格里菲斯（Griffith）首先发现肺炎球菌的转化现象。肺炎球菌是一种病原菌，存在两种类型：光滑型（S）和粗糙型（R，Rough）S型有荚膜，菌落光滑，能使人和动物得病死亡。R型无荚膜，粗糙，不能使人和动物得病。以上实验说明，加热杀死的S型细菌，在其细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞，并使R型细胞获得稳定的遗传性状。1944年，O.T.Avety、C.M.Macleod和M.Mccarty从热死的S型中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化实验：（1） 从活的S菌中抽提各种细胞成分（DNA、蛋白质、荚膜多糖等）（2） 对各组分进行转化试验。从上述结果中可知，只有S型细菌的DNA才能将S的R型转化为S型，而且DNA纯度越高，转化效率也越高，直到只取用纯度为6*10-6g的DNA时，仍有转化能力，这就说明，S型菌株转移给R型菌株时，决不是某一遗传性状（在这里是荚膜多糖）的本身，而是以DNA为物质基础的遗传因子。（二） 噬菌体感染实验： 为进一步证明生物的遗传物质是DNA，1952年候喜（A、Hershay）和蔡斯（M、Chase），用大肠杆菌T23噬菌体做了噬菌体感染实验。他们首先将Ecoli培养在放射性32PO43或 35SO42作为P或S源的培养基中，结果35S 存在于蛋白质，而32P只存在于核酸，然后让T2噬菌体侵染，从而使T2被标记上S和P，接着让具放射性的T2感染不含放射性元素的大肠杆菌，并在噬菌体复制前进行搅动并离心，得上清液和沉淀物，结果发现S位于上清液而P位于底部，这说明蛋白质外壳没有进入Ecoli，由于搅动而脱落，且较轻，故位于上部，而DNA进入菌体，且较重，被沉淀下来。对沉淀液进行培养发现有大量完整的T2噬菌体出现，因此证实了DNA是遗传信息的载体。（三） 植物病毒的重建实验：1965年美国学者法朗克-康勒特（H、FraenrelConrat）用含RNA的烟草花叶病毒进行了植物病毒重建实验。他将TMV（烟草花叶病毒）放在一定浓度的苯酚溶液中振荡，将它的蛋白质外壳与RNA核心分离，RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草，且能分离出正常的病毒离子，证明DNA是遗传物质，另外，他还选用了另一株与TMV近似的霍氏车前花叶病毒（HRV）进行实验。 从图中可以看出，用TMV的RNA和HRV的蛋白质外壳重建的杂合病毒去感染烟草时，烟叶上出现的是典型的TMV病斑。再从分离出来的新病毒是未带有任何HRV痕迹的典型TMV病毒，反之亦然。这充分地证明了核酸决定蛋白质，是遗传物质。第二节 基因突变和诱变育种一、 基因突变： 简称突变，是指生物体内遗传物质的分子结构突然发生的可遗传的变化。突变机率一般在10-6-10-9。（一） 突变类型： 突变的类型很多，我们按突变后极少数变株的表型是否能在选择培养基上加以鉴别区分，分为选择性突变株（Selection Mutont）：凡能用选择性培养快速选择出来的突变株。反之称为非选择性突变株。选择性突变株有：营养缺陷型、抗性突变型、条件致死突变型。非选择性突变株有：形态突变型、抗原突变型和产量突变型。下面我们介绍一下：（1） 营养缺陷型（Auxotroph）：某野生型菌株（Wild Tyain Strain）由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力。因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型称-。加上某生长因子可生长。微生物可产生很多有价值的代谢产物，但它们有完善的调节机制，因此这些产物是非常少的，营养缺陷型可帮助我们解决这一问题。如我们可以通过外加缺陷型营养物，克服其生长障碍，又可使最终产物不至于因积累而引起抑制。见沈P232（2） 抗性突变型：（Resist Mutant）由于基因突变而使原始菌株产生了对某种化学药物或致死物理因子抗性的变异类型。如解烃棒状杆菌可产生棒杆菌素，它是氯霉素的类似物。抗氯霉素的解烃棒状杆菌突变株能产生4倍于亲株的棒杆菌素。另外抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它产物的产量。可见沈P233（3） 条件致死突变型（Condtimal Lethal Mutant）：某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并实现基表型，而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型称为-。如T4噬菌体突变株在25。C下可感染其Ecoli宿主，而在37度却不能感染。叫温度条件突变型。该种突变型也可用于提高代谢产物的产量。如某一菌株在30。C时菌体正常生长，40。C时菌体死亡。经诱变处理后，使其在30。C时积累菌体，40。C时积累代谢产物。可见沈P233（4） 形态突变型（Morphological Mutant）： 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异。如有些菌种孢子有无，孢子颜色，鞭毛有无，荚膜有无突变；菌落表面光滑、粗糙、噬菌斑大小清晰度等突变。（5） 抗原突变型（Contigenic Mutant）： 由于基因突变而引起的抗原结构发生突变的变异类型。如细胞壁缺陷变异（L型细菌）、荚膜变异或鞭毛变异等。（6） 产量突变：由于基因突变而获得的代谢产物产量上高于或低于原始菌株的突变株，称为-。前者为正突变，后者为负突变。（二） 突变率：（Mutation Rate） 每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率称突变率。如突变率为10-8的，表示某一细胞在108次分裂中会发生一次突变，。也可以用一个群体第一世代中产生突变株的数目来表示，如一个108个细胞的群体，当其分裂为2*108个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率为10-8。 突变是独立发生的，一个基因突变不会影响其它基因的突变率，这一点也说明一个细胞同时发生两个基因突变的几率是极低的，为每个基因突变率的积。（三）突变的特点： 在生物界，由于遗传物质的本质是一致的，故突变的特点也具有一致性。（1） 不对称性：指突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。这一说法乍听似乎很矛盾，如：细菌在含青霉素的环境下，出现了抗青霉素突变体；在紫外线作用下产生了抗紫外线突变体等。从表面看他们似乎有直接的关系，是诱因，其实不然，原因是原群体中本来就有抗霉素突变株，只是在青霉素作用下把它选择了出来。（2）自发性：各种突变可以在没有诱因的情况下发生，即自然界中时时存在突变。（3）稀有性：自发突变随时发生，但对某一特定基因发生率极低10-610-9。（4）独立性：即每一个基因发生突变是独立的，没有相互关联。（5）诱变性：即通过诱变剂可提高突变率。一般可提高10105倍。（6）稳定性：由于突变是遗传物质结构发生变化，因而具有遗传稳定性。（7） 可逆性：原始野生型变为突变型为正向突变。相反称为回复突变或回变。（四） 基因突变的自发性和不对应性的证明： 在各种基因突变中，抗性突变最为常见，但在过去相当长的时间里，对抗性产生的原因即是自发的还是环境诱因造成的，有相当的争论。后来人们通过实验证实了突变是自发产生的。1、 变量试验：（Fluctuation Test）： 又称波动试验或彷徨试验。1943年美国学者鲁里亚（S、Luria）和德尔波留克（M、Delbrack）设计了此试验。实验：先将大肠杆菌菌液分成等量的两部分，一部分装在大试管，一部分分装在50支小试管中，然后统一放在恒温试管中，培养24-36小时，然后分别接种到固体培养皿上，一支大试管接50副培养皿，50支小试管分别接一副培养皿。因固体培养基含有噬菌体，故一般大肠杆菌不生长，生长的只有是抗性突变体，试验结果是：从一支大试管生长出来的菌落抗性突变菌落数量基本一致，而从50支小试管中分别培养出来的抗性突变菌落差距非常大。（如果说噬菌体是诱引的话，则出现噬菌斑的情况应基本相同或相似，但却不一致，故-）证明：抗性突变体是在接触噬菌体前就出现了，出现突变的时间越早，产生的菌落就越多，说明抗性突变体的出现与是否接触噬菌体无关。见图解2、 涂布实验：（Newcombe Expetiment）1949年Newcombe设计了这一实验：先在12只培养皿中涂以数目相等的大肠杆菌细胞，经大约5小时培养，于是在平板上长出大量的微菌落，取其中6支直接喷上噬菌体，另6支先用灭菌玻璃棒均匀涂布一遍，然后再喷噬菌体，经过夜培养计算两组培养皿中抗性菌落数。（涂布可将抗性株涂开）。结果：发现，在涂布过的一组中，共长出抗性菌落353个，要比未经涂布过的28个，多得多。说明：该抗性突变发生在未接触噬菌体之前。噬菌体的加入只不过起甄别作用，而不是诱导突变的因素。3、 平板影印培养试验（Replica Plating）1952年莱德伯格夫妇（V，Lederberg）设计的。实验：印章的做法是取一块比培养皿略小的木块，一端用缄布包起来，缄布上许多小纤维起到接种针的作用。在进行试验时，先用培养液培养大肠杆菌，再将菌液涂布在固体培养基上，待长出菌落后，用影印法先在新鲜的固体培养基上打一个印，再在含链霉素的另一个培养皿上打一个印。在含链霉素的培养皿上长出来的是抗链霉素突变体菌落然后再在不含链霉素的培养基上找出相应位置上的菌落，用含链霉素的培养基上找出相应位置上的菌落，用含链霉素的培养基鉴别，发现也是抗链霉素突变体，由于两者来源相同，说明是非链霉素诱变，而是自发的。（五） 基因突变的机理： 引起基因突变的原因很多，可以是自发的，也可以是诱发的，突变的类型可概括如下：P713 1、 诱变机制： 诱变一般都是诱变剂诱发的突变，诱变剂的种类很多，作用方式多样。我们把凡能提高突变率的任何理化因子，都可称为诱变剂。（1） 碱基置换： 置换是染色体一点微小的损伤，也称点突变。一般只涉及一对碱基，置换又可分成两种情况，即转换和颠换。转换（Transition）即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶置换。颠换（Transversion）即一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。（2） 移码突变（Frame-Shift Mutation）：指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸增添（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。吖啶类染料：如原黄素、吖啶黄和-氨基吖啶等。都是能引起移码突变。（3） 染色体畸变（Chromosomal Aberration）：某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除能引起点突变外，还会引起DNA大损伤，即染色体畸变。缺失：染色体丢失了部分片段称-重复：在一对同源染色体的不同部位上各有一个断裂点，一条染色体的断片接到另一条染色体的相应部位，结果使后者发生重复。易位：两条非同源染色体同时发生断裂，断片相互交换位置后重接，就形成易位。倒位：一条染色体两处发生断裂后，中间的片段转动180后重接就叫- 过去，人们总认为基因是固定在染色体DNA上的一些不可移动的核苷酸片段。但近年来，发现有些DNA片段不但可在染色体上移动，而且还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒跳到另一个质粒或染色体，甚至还可从一个细胞转移到另一个细胞。在这些DNA顺序的跳跃过程中，往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生。这似乎就是自然界所固有的“基因工程”。目前已把在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序称作转座因子（transposblb element），也称作跳跃基因（jumping gene）或可移动基因（moveable gene）。 转座因子主要有三类，即插入序列（IS， insertion sequence）、转座子（Tn， transposon，又称转位子，易位子）和 Mu噬菌体（即 mutator phage，诱变噬菌体），现分述如下。（1）IS 特点是分子量最小（仅 0 .7 1.4kb），只能引起转座（transPOsition）效应而不含其他任何基因。可以在染色体、F因子等质粒上发现它们。已知的IS有5种，即ISI、ISZ、IS3、IS4和IS5。 Ecoli的F因子和核染色体组上有一些相同的IS（如IS2， IS3等），通过这些同源序列间的重组，就可使F因子插入到Ecoli的核染色体组上，从而使后者成为Hfr菌株。因Is在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。IS引起的突变可以回复，其原因可能是IS被切离，如果因切离部位有误而带走IS以外的一部分DNA序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变。 （2）Tn 与IS和Mu噬菌体相比，Tn的分子量是居中的（一般为225kb）。它含有几个至十几个基因，其中除了与转座作用有关的基因外，还含有抗药基因或乳糖发酵基因等其他基因。Tn虽能插到受体DNA分子的许多位点上，但这些位点似乎也不完全是随机的，其中某些区域更易插入。 （3）Mu 噬菌体 它是Ecoli的一种温和噬菌体。与必须整合到宿主染色体特定位置上的一般温和噬菌体不同，Mu噬菌体并没有一定的整合位置。与IS和Tn两种转座因子相比，Mu噬菌体的分子量最大（37kb），它含有20多个基因。Mu噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2是营养缺陷型突变。 以上我们已讨论了染色体的各种畸变类型。必须指出的是，染色体畸变在高等真核生物中一般很容易观察，但在微生物中，尤其在原核生物中，还是近年来才证实的。 需要说明的是，许多理化诱变剂的诱变作用都不是单一功能的。例如，上述的亚硝酸就既能引起碱基对的转换作用，又能诱发染色体畸变的作用；一些电离辐射也可同时引起基因突变和染色体畸变等作用。2、 自发突变机制：自发突变是指在没有人工参与下生物体自然发生的突变。自发突变并不是没有原因，而是人们认识不到。下面介绍几种自发突变的可能机制：（1） 背景辐射和环境因素引起突变：如宇宙空间的各种短波或高温现象等。自然界中普遍存在的一些低深度物质等。（2） 微生物自身有害代谢产物的诱变效应：如：H2o2，它是微生物体内一种较普遍的代谢产物，它对某些种类的微生物有诱变作用，如脉孢菌。（3） 互变异构效应：是由于ATCG四种碱基在化学结构上发生异构现象而引起DNA复制合成时出现错误。（4） 环出效应：即环状突出效应，因为DNA是由两条单链组成，如果其中一条单链在复制时出现一个小环，则小环上的基因就会在复制时被越过，从而发生突变。 （六） 紫外线对DNA的损伤及其修复： 在DNA的成分和结构中，嘧啶对紫外线（U、V）的敏感性比嘌呤强得多。紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，它的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链间结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会很少，一旦形成，双链不能打开，引起DNA等的复制或转录不能进行，使细胞死亡。（过渡）但微生物具有一定对损伤后的DNA修复的能力。（1） 光复活作用：（Photorea Ctivation）把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下，可明显降低其死亡率，这种现象就称为-。这一现象是由A、Kelner发现的。实验：用Ecoli.将8*106个/ml的Ecoli用紫外线照射一定时间后，发现只有100个/ml的Ecoli存活；如果有昭射后，立即放到可见光下30min,则存活量为2*106个/ml 原理：是在黑暗的条件下，光激活酶与胸腺嘧啶二聚体结合，当有光的情况下，该酶发挥作用，使二聚体再分解成单体。（2） 暗修复作用（Darl Repair）：又称切除修复，它是用来修复活细胞内被损伤的DNA的一种机制。只是这种修复与光没有关系。 过程：（1）内切核酸E先在二聚体的5端切开一个缺口。（2）外切核酸E从5到3端将二聚体切除。（3）在DNA聚合酶的作用下，以DNA的另一条互补链为模板，重新合成一段DNA链。（4）通过连接E的作用把新合成的一段DNA连接起来。即完成修复。二、突变与育种：（一） 自发突变与育种：1、 从生产中自然选种：在工业生产中，微生物总是以一定频率发生着突变，一些有经验的微生物工作者，可以通过观察，发现一些向正向突变株。然后进行分离、纯化、试验等。即可找到一个好种。2、 定向培育优良品种：定向培育是指用某一特定因素（如温度、药物）长期处理某微生物群体，并不断移种传代（目的是增加突变频率），以达到累积并选择相应自发突变株的目的。是一种古老的育种方法。但由于自发突变频率低，变异程度轻微，故速度缓慢，效果不明显。如巴斯德曾用42。C去定向培养炭疽杆菌，使该菌丧失了产芽孢能力和致病力，从而可以制成活菌疫苗，接种于牛羊等体内来预防疾病，还有如卡介苗的成功，就是经历了13年，230多代移种而获得成功的。采用梯度平板法可用来筛选代谢物拮抗物的突变株。以提高我们要利用的代谢产物的量。步骤如下：先在培养皿中加入10ml一般培养基，并摆成斜面使凝固，再在原培养基上倒入10ml含有代谢物类似物的培养基，此时代谢类似物形成了一定浓度梯度的培养面，然后接种培养物，培养，那么在培养基中部（浓度较适中的地方）长出具有抗性的菌株，就可用来作生产试验，以便从中获得抗性菌株，获得更多的代谢产物。(二） 诱变育种：是指采用物理或化学的方法处理微生物细胞群，促使其显著提高突变率，然后再筛选优良突变株的方法，称-。当前在工业生产中使用的高产菌种，很多都是采用此方法诱导出来的。诱变育种除能提高代谢物的产量外，还能提高其质量简化工艺过程等作用。1、 诱变育种的基本环节：2、 诱变育种就注意的问题：（1） 选择简便有效的诱变剂：诱变剂的种类很多，有物理的、如UV；激光、X射线、Y射线、中子等，化学的如烷化剂，碱基类似物等，但我们要尽量选择简便易行、切实、有效的方法，如U、V灯（15W），在无光的情况下可照射，时间为10S-20S，距离30cm左右。原则：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。有了合适的诱变剂，还要采用简便有效的诱变方法。补充介绍一下诱变剂有实际中的一个应用：艾姆斯试验。用艾姆斯试验测定潜在化学致癌物的基本原理是：鼠伤寒沙门氏菌即“S.t ”的的组氨酸缺陷型（his）菌株在基本培养基平板上不能生长，如发生回复突变则能生长。含可疑“三致”物，例如黄曲霉毒素、二甲氨基偶氮苯（奶油黄）或“反应停”（早期一种用于降低妇女妊娠反应的药物，因有很强的“三致”性，故早已淘汰）的试样，加入鼠肝匀浆，保温一段时间后，吸入滤纸片中，然后将滤纸片放置于上述平板中央。经培养后，出现三种情况：如在平板上无大量菌殖产生，说明试样中不含诱变剂；如在纸片周围有一抑制圈，其外才是大量菌落，说明试样中某诱变剂的浓度很高；如在纸片周围即长大量菌落，说明诱变剂的浓度合适。顺便要解释的是，某些物质本身并非诱变剂，可是这种“前诱变剂”往往进入动物体后经过生物化学修饰才变成诱变剂。为弥补这一缺陷，就应在测试系统中加入含有能使这类“前诱变剂”变为诱变剂的酶类（例如羟化酶等）的鼠肝提取物。（2） 挑选优良的出发菌株。这一点主要在生产中积累的经验。A、 选择生产中选育过的自发突变株。B、 采用具有有利性的菌株（生长速度快，营养要求低等）C、 选择已发生其它变异可提高其它诱变因素的敏感性。D、 选择增变菌株，因为它对诱变剂的敏感性较高。E、 选择能产生所需代谢物的菌株。（3） 最好处理单细胞悬液：单细胞悬液分散均匀，能普遍接触诱变剂；且能长出纯菌落。（4） 选用合适的诱变剂量。即选择一个能显著提高诱变率，又能增加变异幅度的剂量。物理因素诱变剂量=强度*时间化学因素诱变剂量=浓度与处理时间（5） 充分利用复合处理的协同效应：如： A两种或多种诱变剂的先后使用B同一种诱变剂重复使用。C两种或多种诱变剂的同时使用。采用复合处理方法，可显著提高诱变效果。（6） 利用形态、生理与产量间的相关指标选择： 意思是利用在实践中积累的经验，加快筛选的速度，如人们在对产维生素B2的阿舒假囊酵母的筛选过程中发现，高产株的形态特征是：A、菌落直径呈现中等大小（810mm）B、色泽深黄C、表面光滑D、菌落各部分呈辐射对称等，又如产灰黄霉素菌荨麻青霉中菌落棕红色加深者为高产株等。另外还可以用一些生理指标作为选择的一种手段。（7） 设计高效的筛选方案和方法：通过诱变处理后，大部分菌株呈现负突变。而只有少数是正突变，因而在筛选过程就象沙里淘金，故人们设计了筛选方案。 筛选方案：一般采用初筛和复筛的方案。（人们总结出来的类似正交等方法）初筛以量为主，复筛以质为主。步骤是：然后进行第三、四等轮回，直到获得良好的结果为止。（1） 筛选方法：一般也可采用初筛和复筛两种方法对突变株进行生产性能测定。初筛：可在平板培养皿中进行，亦可在摇瓶中进行，特点是快速简便，工作量小，直观性强（可直接观察到生长圈、变色圈、透明圈等现象）缺点是：与发酵罐中进行液体深层条件差距较大。复筛：对突变株的生产性能作比较精确的定量测定采用复筛的方法。一般是将微生物接种在三角瓶内的液体培养基中作振荡培养，然后对培养液进行分析测定。其优点是：培养液接近发酵罐的条件，能够测定较精确的数据。 1971年，国外有人报道了筛选春日霉素（即“春雷霉素”）生产菌时所采用的一种琼脂块培养法。此法构思较巧妙，实验效果也较好（一年内提高产量10倍左右），值得介绍。其要点是：把诱变后的春日链霉菌的分生孢子悬液涂布在营养琼脂平板上，待长出稀疏的小菌落后，用打洞器一取出长有单菌落的琼脂小块，并分别把它们整齐地移入灭过菌的空培养皿中，保持合适的温、湿度。经培养45天后，把每一长有大菌落的小块再转移到含有供试菌种（即拮抗对象）的琼脂平板上，以分别测定它们的抗生素抑制圈的直径，然后择优选取之。此法的关键是用打洞器取出含有一个小菌落的琼脂块并对它们作分别培养。在这种情况下，各琼脂块所含的养料和接触空气的面积基本相同，且产生的代谢产物不致扩散，因此测得的数据与摇瓶条件下十分相似，然而工作效率却大为提高。琼脂块培养法的示意图。3、 营养缺陷型突变株的筛选：（1） 常用到的几种培养基：（与营养缺陷株有关的三种培养基）A、 基本培养基：（MM，Minimal Medium）：指仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合培养基，不同种类的微生物其MM是不一样的。B、 完全培养基（CM Complete Medium）：凡能满足一切营养缺陷株营养需要的培养基称-。一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素和碱基之类的天然物质（如蛋白胨、酵母膏等）。C、 补充培养基（SM Supple Madium）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基，称为-。它是由基本培养基再添加某种营养缺陷型菌株所不能合成的物质构成的。（2） 与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：A、 野生型：（Wild Type）：在自然界中分离的任何微生物在其发生营养缺陷突变之前的原始菌株，称该种微生物的野生型。B、 营养缺陷型（Auxo Troph）：野生菌株经诱变后，由于丧失了某种酶的合成能力，因而只能在添加了该E合成产物的培养基上生长，这类菌株称-。C、 原养型（Prototroph）：一般指营养缺陷型突变株经回变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。（3） 营养缺陷型的筛选方法： 变处理同上：淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型较少，因而需要将野生型菌株淘汰掉，留下缺陷型。一般采用抗生素法或菌丝过滤法。抗生素法：主要是利用抗生素对微生物具有抑制作用。如，用青霉素法，可以杀死生长繁殖着的细菌，但不能杀死未萌发或休眠的细菌。在含青霉素的培养基中野生型细胞被抑制，而“浓缩”缺陷型。菌丝过滤法：适用于丝状的真菌或放线菌，原理是在基本培养基上，野生型孢子可萌发成菌丝，而缺陷型可休眠。如用合适的滤纸，可将缺陷型孢子过滤出来，如此重复便可得缺陷型。（4） 检出缺陷型：方法很多 夹层培养法：先在培养皿上倒一薄层基本培养基，凝固后再倒一层经过诱变处理的菌液，其上再浇一层基本培养基；经培养后，对首次出现的菌落用记号笔在皿底标记，然后再倒一层完全培养基，再培养，出现的形态较小的新菌落，多为缺陷型。 限量补充培养法：把诱变处理后的细胞接种在含微量（0.01%）蛋白胨的基本培养基上，野生型迅速生长，而生长较慢的多为缺陷型。也可在基本培养基上加入微量相应物质，从而得到某一特定营养缺陷型。逐个检出法： 把经过诱变的细胞涂布在平板上，待长出单个菌落后，用接种针把单个菌落逐个地分别接种到基本培养基和另一完全培养基上，培养，如果在完全培养基的某一个部位长出菌落，而在基本培养基上相应部位却不长，说明是一营养缺陷型菌株。影印接种法：将诱变处理后的细胞涂布在一完全培养基的表面上，经培养长出许多菌落，用影印法将其接种到另一基本培养基平皿上，培养，比较两平板的菌落，如果发现在完全培养基上生长，而在基本培养基上不生长的菌落就是一个营养缺陷型。（4）鉴定缺陷型：可用生长谱法来进行，步骤是：把生长在完全培养液中的营养缺陷型细胞或试管斜面上的孢子洗下，经用无菌水离心清洗后，配成10-10个/mol的悬液，然后取0.1ml与基本培养基混合再倒在培养皿上，待平面稍干后，在皿背面划上若干区域，再在下面加上微量的氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等营养物的粉末或结晶（滤片也可）。经培养后，如果发现在某一营养物的周围有微生物的生长圈，说明它就是该营养物的缺陷型。(5)营养缺陷型的应用：其在研究和实践中都有极其重要的意义。它可作为研究代谢途径和杂交、转化、转导、原生质体融合、质粒和转座因子等遗传规律所不可缺少的标记菌种；也可作为氨基酸、维生素、碱基等物质生物测定的实验菌种；在生产中，可直接用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株；也可作为菌种杂交、重组育种和利用基因工程进行育种时所不可缺少的带有特定基因标记的亲本菌株。第三节 基因重组概念：凡把两个不同性状的个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新型遗传个体的方式称-或遗传重组。基因重组的能动性相对较强（和突变比。因已知了供体和受体）。重组是在分子水平上进行的，可以说是遗传物质分子水平上的杂交。我们平时所说杂交是细胞水平的，但重组的内容不仅局限于杂交一种形式，还有其它形式，如真核微生物中的有性杂交，准性杂交，以及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等。一、 原核微生物的基因重组： 原核微生物基因重组的主要方式有转化、转导、接合和原生质体融合等几种形式。（一） 转化：（Transformation）受体菌（感受态细胞）直接吸收了来自同源或异源的DNA片段（质粒和染色体DNA），通过交换，把它整合到自己的基因组中，再经复制就使自己变成一个转化子（Transformant）。这种受体菌直接接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象就称转化或转化作用。（周P256图8-25）感受态（competence）：指受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。不同细胞感受态出现的时期不同，如：有的出现在生长曲线中的指数后期；有的出现有指数末期或稳定期。在外界环境中，环腺苷酸（cAMP）及Ca2+对细胞的感受态影响最大。如有人发现，cAMP可使嗜血杆菌细胞群体的感受态水平提高一万倍。现已知感受态因子是一种胞外蛋白质，它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分，以让细胞表面的DNA受体显露出来，便于接合。转化因子的本质是DNA，实现转化所需的DNA浓度是极低的。转化现象在原核生物中较为普遍；在放线菌和兰细菌以及少数真核微生物中也有报道，但较少。具体步骤可参阅周P256 可分为以下几个阶段：双链DNA片段与感受态受体菌细胞表面的特定位点结合。在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成片段；DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，分子量小于5*105的DNA片段不能进入细胞；来自供体的单链DNA片段在细胞内与与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA交换、整合和取代，形成一个杂合DNA区段受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获得，细胞分裂后，一个是转化子，另一个细胞与原始受体菌一样。如果把噬菌体或其他病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒后代，这种现象称转染（transfection）。它与转化不同之处是病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌，中间也不发生任何遗传因子的交换或整合，最后也不产生具有杂种性质的转化子。（二） 转导：（Transduction）以噬菌体为媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合从而使后者获得前者部分遗传性状的现象称为转导。获得新遗传性状的受体细胞就称为转导子。（Transductant）（遗传物质通过噬菌体的携带而转移的基因重组现象称为-）转导现象是由J.Lederberg等在鼠伤寒沙门氏菌中发现的。以后在原核生物中都陆续发现。转导现象在自然界中普遍存在，它在低等生物的进化过程中，很可能是一种产生新基因组合的重要方式。转导的种类：1、 普遍性转导（Generalized Transeuction）噬菌体在侵染寄主细胞后在寄主细胞内复制，在其装配阶段，正常情况下，是将自身的DNA包装在衣壳里，异常情况下，将寄主细胞的一段DNA包裹进去，而自身的DNA却没有包进去，虽然这种情况很少（10-510-8），但由于噬菌体的繁殖能力很强，子代众多，因此这种不正常的噬菌体出现的机率还很多，这种包裹寄主DNA片段的噬菌体，当侵染新的寄主时，由于没有自己的DNA，或自己的DNA不完整，不能在新的寄主细胞里进行复制，因此不能使新寄主裂解，但却能将所包裹的DNA片段带入寄主并与寄主细胞的DNA进行基因重组，从而使寄主细胞发生变异。普遍性转导这一名词的来源是由于通过这种转导，可以把供体菌的任何一段DNA片段带给受体细菌。（也是机率问题）2、 流产转导（或流产普遍转导）：在普遍性转导过程中，进入到受体菌的供体细菌DNA片段不与受体细菌DNA整合，也不进行复制，但随着受体细菌的分裂，在两个子细胞中只能有一个能得到这种来自供体细菌的DNA片段，这种转导称为-（Abortive Trsnsduction）举例说明：大肠杆菌噬菌体参与局限性转导。噬菌体作为温和噬菌体在侵染大肠杆菌K12后，整合在细菌DNA的一定位置上，如与合成生物素和发酵半乳糖有关的基因上，（这两个基因分别用Bio和Gal表示）当温和噬菌体被诱导为烈性噬菌体时，噬菌体从大肠杆菌K12中释放出来。释放出来的噬菌体一般来说是正常的，但极少数情况下也可能释放出异常的噬菌体，这些异常噬菌体带有Bio和Gal基因中的一个，而留下一段噬菌体的DNA在寄主细胞的DNA上，这样当带有Bio或Gal基因的噬菌体侵染另一个细菌时，就能把上述两个基因中的一个带给受体菌，并进行基因重组而使受体菌发生突变。也就是说使原来不具备合成生物素或发酵半乳糖的细菌具有合成生物素或发酵半乳糖的遗传选择性。（杨卧康P213）补图P7-31（三） 接合：（Conjugation）供体菌（雄）通过直接接触（其性菌毛）受体菌（雌），而产生的遗传信息的转移和重组过程叫接合。前者传递不同长度的单链DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状。把通过接合而获得新性状的受体细胞就称为接合子。在细菌和放线菌中都存在接合现象。现在研究的比较透彻的是Ecoli。在研究中发现其是有性别之分的，性别的区分就在于细胞内是否存在F因子。F因子又称致育因子（Fertility Factir），它是一种质粒，化学成分是DNA，环状，能编码4060种蛋白质，大肠杆菌的F因子约为细胞总DNA的20%，F因子能独立于细胞核DNA而复制。雌性细菌不含F因子，称F-菌株。又根据F因子存在于细胞内的位置不同分为F+菌株（雄，F因子在细胞内游离）Hfr菌株（其F因子整合到细胞核的DNA上）。F因子能整合到细胞核DNA上，也能从上面脱落下来，在脱落时有时能带下一小段细胞核DNA，我们又把F因子这种能以游离态存在又能整合到细胞核DNA上的质粒又称为附加体（Episome）。把含有游离的但带一小段细胞核DNA的F因子的细菌称为F、菌株（雄）。以上三种雄性菌株通过性纤毛与雌性菌株接合，可产生以下结果：1、 F+和F-接合产生二个F+菌株P7-332、 F、菌株和F-菌株接合产生二个F、菌株3、 Hfr和F-接合情况较为复杂（补充）细菌细胞内除F因子外，还有其它的质粒，如K因子（抗化学药剂质粒）。产细菌素因子（与细菌素产生有关）；降解质粒（降解有机物）等很多种类的质粒。（四） 原生质体融合（protoplast fusion）通过人为的方法，使遗传性不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程，称为原生质体融合。这样技术是70年代后期才发展起来的一种育种新技术。原核细胞与真核细胞都能进行融合。具体步骤如下：先选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为为亲本，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶（如细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理，真菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶等）去除细胞壁，再将形成的原生质体（实际上往往是些脱壁不完全的球状体）进行离心聚集，并加入促融合剂PEG（聚乙二醇Polyethylene glvcol）或通过电脉冲等促进融合，然后在高渗溶液中稀释，再涂在能使其再生细胞壁和进行分裂的培养基上。待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，鉴定它们是否为融合子，最后再测定其他生物学性状或生产性能。目前，有关原生质体融合在育种工作中的研究甚多，成绩显著，但有关原生质体的遗传机制，还在探索中。二、真核微生物的基因重组：在真核微生物中，基因重组的基本方式有：有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。我们只介绍有性杂交和准性杂交。（一） 有性杂交：是发生在细胞水平上的一种遗传重组方式。凡能产生有性孢子的酵母菌和霉菌，原则上都可采用有性杂交的方法进行育种。以酿酒酵母为例加以说明：P7-34甲菌、乙菌分别接种产生子囊减分产生4个子囊孢子/子囊分别将子囊冲洗下来破坏子囊使孢子释放（E法研磨）分别离心得孢子（n）将孢子涂布平板得菌落（n）将菌落细胞混合离心，使接触新组合双倍体出现筛选良种（二） 准性杂交：（Parasexual Hybridization）周265要了解准性杂交，先介绍准性生殖。准性生殖是一种类似于有性生殖，但更原始的一种生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式导致低频率的基因重组的一种育种方式。准性杂交常见于真菌、尤其是半知菌中。过程：同种不同菌株的菌丝相互靠拢并接触-质配、核配-异核体-（偶尔）核融合形成杂合二倍体-有丝分裂杂合双倍体分离-筛选-育种 周266准性生殖举例： 灰黄霉素生产菌荨麻青霉的准性育种 选择亲本：即选择来自不同菌株的合适的营养缺陷型作为准性杂交的亲本。由于在荨麻青霉等不产生有性抱子的霉菌中，只有极个别的细胞间才发生联结，而且联结后的细胞在形态上无显著的特征可找，因此，同研究细菌的接合一样，必须借助于营养缺陷型这类绝好的选择性突变作为杂交亲本的性状指标，如在图838中的A-B+与A+B-。强制异合：即用人为的方法强制两菌株形成异核体。将A-B+和A+B-两菌株所产生的分生抱子（约106 107）相互混匀，用基本培养基倒培养皿平板，同时对单一亲本的分生孢子也分别倒一平板，作为对照。经培养后，要求前者只出现几十个菌落，而后者则不长菌落。这时，出现在前者上的便是由A-B+和A+B两菌株的体细胞联结所形成的异核体或杂合二倍体菌落。移单菌落：将培养皿上长出的这种单菌落移种到基本培养基的斜面上。验稳定性：就是检验新菌株究竟是不稳定的异核体，还是稳定的杂合二倍体。先把斜面菌株的孢子洗下，用基本培养基倒夹层平板，经培养后，加上一层完全培养基。如果在基本培养基上不出现或仅出现少数菌落，而当加上完全培养基后却出现了大量菌落，那么，它便是一个不稳定的异核体菌株（如图838中的）；如果在基本培养基上出现多数菌落，而加上完全培养基后，菌落数并无显著增多，那么，它就是一个稳定的杂合二倍体菌株（如图838中的）。在实际工作中，发现多数菌株只属于不稳定的异核体。促进变异：把上述稳定菌株所产生的分生孢子用紫外线、，射线或氮齐等理化因子进行处理，以促使其发生染色体交换、染色体在子细胞中分配不均、染色体缺失或畸变以及发生点突变等，从而使分离后的杂交子代（单倍体杂合子）进一步增加新性状的可能性。 在上述工作的基础上，再经过一系列生产性状的测定，就有可能筛选到比较理想的准性杂交种。第四节 基因工程基因工程的出现是伴随人类对遗传物质的认识程度不断加深而发现的，是70年代后诞生的一项新技术。又叫遗传工程或重组DNA技术。是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质（DNA大分子）提取出来，在离体情况下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，再一起导入某一更容易生长、繁殖的受体细胞中，让外源DNA进行正常的复制和表达。基因工程是一种在离体情况下，人为可以设计的可超远缘杂交的一种定向育种方式。我们把获得新功能的微生物称为“工程菌”，动植物称为“工程动植物或转基因动植物”。一、 基因工程的基本操作步骤：1、 取得目的基因：方法：A：可用密度梯度超离心方法，从供体生物中得到；B；通过反转录酶的作用由mRNA合成DNA。C：由化学方法合成特定功能的基因。2、选择适当的载体：有了目的基因后，还必须有符合要求的运送载体将其运送到受体细胞中进行增殖和表达。载体必须符合以下条件：(1)具有自我复制能力；（2）能在受体细胞内大量增殖；（3）载体上最好只有一个限制性内切酶的切口，使目的基因能融合到载体的固定位置上；（4）载体上必须有一种选择性遗传标记，以便及时把极少数“工程菌”或“工程细胞”选择出来。3、目的基因与载体DNA的体外重组 即用限制性内切酶的处理或采用人工手段将DNA进行加工，使目的基因与载体DNA连接起来，组成一个有复制能力的遗传物质，即重组载体。4、将重组载体引入受体细胞：这一步是为了使目的基因扩增和表达，以获得预定的效果，达到最终目的。现在常用受体细胞是微生物细胞，当然也可以是动物或植物细胞，因为微生物细胞有许多优点，比如速度快，周期短等优势。将重组载体引入受体的方法很多，若以重组过的质粒作载体可以用转化的手段；若以病毒为载体，可用感染的方法。二、前景：基因工程是本世纪70年代开始发展起来的，但由于其目的性强，因而发展速度快。（一）工业上：人们可以利用基因工程技术制取在自然状态下存在很少的物质，如胰岛素，10万克胰脏只能提取34克胰岛素，而用“工程菌”几升发酵液即可取得同样数量的产品。生产抗生素、干扰素、激素等。（二）农业上：生产固氮，将固N基因移入植物细胞，将木质素或纤维素分解E的基因移入酵母细胞，以便充分利用植物桔（三）医疗事业：利用基因工程治疗遗传病。（四）环保事业：利用“工程菌”分解有毒物质或不易分解的物质等。（五）促进生物学基本理论的研究。三、微生物与克隆载体： 在基因工程中，外源DNA片段进行克隆，需要一个合适的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增，这种以扩增外源DNA为目的的载体，称为克隆载体（cloning vector）.作为载体必须具备以下条件：（1）在细胞内能独立复制，具有复制起始序列，能进行有效扩增（2）必须具有若干限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的片段插入（3）必须具有可选择的遗传标记，便于筛选。目前基因工程中使用的载体均来自微生物，主要包括六大类：质粒载体、入噬菌体载体、柯斯质粒载体、