浅析亮丙瑞林的固相合成分析毕业论文.doc

毕业论文浅析亮丙瑞林粗品合成工艺的研究Analysis of leuprolide crude synthesis technology of班 级 学生姓名： 学 号： 指导教师： 职 称： 实习单位：徐州工业职业技术学院 徐州工业职业技术学院毕业设计（论文）任务书课题名称浅析亮丙瑞林粗品合成 工艺的研究 课题性质科学实验类班 级 生化102班 指导教师 导师职称 一选题意义及背景本课题从亮丙瑞林粗品的固相合成实验方面探索最佳的合成工艺，通过设计对照实验，分别以HB、HOBT、TBTU三种缩合剂的合成连接实验作为依据，找寻和比较在三种不同条件下的亮丙瑞林合成收率，得出在缩合剂间的最佳合成工艺。二毕业设计（论文）主要内容：1 亮丙瑞林药品的简要介绍2 早期亮丙瑞林粗品的合成工艺比较和优缺点3 设计亮丙瑞林粗品的合成对比实验4. 亮丙瑞林粗品的HPLC的结论分析5. 实验工艺分析三计划进度：110.18 10.25：利用网络查阅课题相关资料（包括亮丙瑞林的临床药物应用、亮丙瑞林的肽链结构分析、亮丙瑞林常用合成工艺研究、固相合成原理等）。210.26 10.28：根据所查资料，结合本课题，设计实施课题的方案，准备实验。310.29 11.11：按照设计方案进行实验。411.12 11.19 答辩：完成毕业论文及答辩。四毕业设计（论文）结束应提交的材料：1、课题实验设计方案； 2、毕业论文；3、实验记录本。指导教师 教研室主任 2012 年 11月 11 日2012 年 11 月 11 日论真实性承诺及指导教师声明学生论文真实性承诺本人郑重声明：所提交的作品是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，内容真实可靠，不存在抄袭、造假等学术不端行为。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含有其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。如被发现论文中存在抄袭、造假等学术不端行为，本人愿承担本声明的法律责任和一切后果。 毕业生签名： 日期：指导教师关于学生论文真实性审核的声明本人郑重声明：已经对学生论文所涉及的内容进行严格审核，确定其内容均由学生在本人指导下取得，对他人论文及成果的引用已经明确注明，不存在抄袭等学术不端行为。 指导教师签名： 日期：摘 要通过对亮丙瑞林粗品的认识和合成工艺研究，分析以往合成方法的优缺点从而探索新的最佳工艺合成条件。利用多肽固相合成法中的Fmoc合成法，根据氨基酸的脱水缩合的肽链延长机理合成亮丙瑞林粗品。研究氨基酸和氨基酸之间以及氨基酸和之间HProCTC树脂(CTC树脂：2-氯三苯甲基氯树脂)的缩合反应。通过使用不同的缩合剂HB,DIC,HOBT之间的对比反应，探索在三种缩合剂之间合成的最佳合成工艺。关键词 固相多肽Fmoc合成法；亮丙瑞林；缩合反应；缩合剂 Abstract The Fmoc synthesis method using the solid phase peptide synthesis method, leuprolide crude product was synthesized according to dehydration condensation of the amino acids in the peptide chain extension mechanism. Between the amino acids and amino acids as well as amino acids and between the H-Pro-CTC resin (CTC resin :2-chloro-trityl chloride resin),a condensation reaction. By using a different condensing agent HB, the contrast between the reaction of DIC, HOBT, Discover synthesis between the three condensing agent in optimum synthesis. Keywords: Solid-phase peptide Fmoc synthesis method; leuprolide ; condensation reaction ;condensing agent目 录摘 要IAbstractII引 言11.1 亮丙瑞林的介绍11.2 亮丙瑞林的生产方法11.3本文合成方法2第二章 实验部分32.1 实验仪器和材料32.1.1 实验仪器32.1.2主要材料32.2全保护肽片段的制备32.2.1制备前的准备32.2.2全保护肽片段的制备步骤32.3 全保护肽片段的切割42.3.1 全保护切割液的配置42.3.2 全保护的切割过程52.4 肽片段C-末端的乙胺化4525肽链的侧链切割52.7粗品分析62.8 HPLC分析6第三章 实验工艺分析9参考文献10附录11一、本文使用的部分英文字母缩写的中文对照：11二、二十种常用氨基酸的分子量11致 谢13 引 言1.1 亮丙瑞林的介绍醋酸亮丙瑞林是一种常用的激素类抗恶性肿瘤药物，为促性腺素释放激素(LHRH，一种十肽)的九肽合成类似物亮丙瑞林的醋酸盐，属LH-RH拮抗剂，LHRH是由下丘脑产生，它能促使垂体前吸释放促性腺激素及卵泡刺激素 (FSH)和黄体生成激素(LH)。本品因结构类似LHRH，作用于垂体前叶后也具有促使FSH、LH的释放功能，从而提高睾丸酮和二氢睾丸酮的血清浓度。临床上用于晚期前列腺癌的维持治疗，但在应用本品约1周后，有活性的受体数目就会减少，促性腺激素的分泌也会减少。在24周后，睾丸酮和二氢睾丸酮的浓度可降至去势水平。当停药后，促性腺激素和雄激素可回升至正常浓度。临床上具有很大的应用价值 1。1.2 亮丙瑞林的生产方法在亮丙瑞林的生产方法中，主要有固相合成方法、液相合成方法以及固液结合合成方法。 在液相合成方法中，由于液相合成法中的每一步产物都需纯化，所以液相的合成方法相对来说比较繁琐，增加多肽合成的生产成本，不太适合生产醋酸亮丙瑞林。由此而产生的固相合成法将多肽羧基端的氨基酸固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次偶联氨基酸，延长肽链、合成多肽。在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的。再经过有效时间的研究进展后，固相合成法又分为了Fmoc固相合成法和Boc固相合成法，在Boc固相合成法中，反复地用酸来脱保护，这种处理带来了一些问题：如在肽与树脂的接头处，当每次用50%TFA脱Boc基时，有约1.4%的肽从树脂上脱落，合成的肽链越长，这样的损失越严重；此外，酸处理会引起侧链的一些副反应，Boc固相合成法尤其不适于合成含有色氨酸等对酸不稳定的肽类。而相对于含有色氨酸的醋酸亮丙瑞林的合成，恰好含有色氨酸，所以Boc合成法并不适合亮丙瑞林的合成。在Fmoc的合成方法中，由于采用了碱可脱除的Fmoc为-氨基的保护基，侧链的保护采用TFA可脱除的叔丁氧基等，树脂采用90%TFA可切除的对烷氧苄醇型树脂，最终的脱保护避免了强酸处理。使得合成含有色氨酸的多肽有了全新的合成方法，同时减少了生产成本，也提高了这些肽链的合成收率，对于亮丙瑞林的生产合成，也提供了很多的捷径。对于新兴不久的固液结合合成的方法中，由于吸收了固相和液相的优点和根据特殊肽链的合成需求而产生的技术有效地改善和弥补了固相和液相合成方法中的不足，对于多肽合成上的发展也有了很大方面的精进，但是由于成本相对较高，在合成价格普通的药物上面很少使用，而对于亮丙瑞林的合成，Fmoc合成方法较为合适1.3本文合成方法本文主要介绍一种Fmoc的合成方法，以CTC树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护九肽树脂，再通过全保护切割出去树脂，获得全保护的九肽。然后通过加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（PyBOP）、二异丙基乙胺(DIEA)和二氯甲烷（DCM）连接C端的NHET，再次通过切割暴露肽链的活性基团，获得亮丙瑞林的粗品。第二章 实验部分本实验通过采用不同的缩合剂（HBTU、HOBT、TBTU）在相同的工艺条件下进行对比实验，观察实验现象和实验结果，了解和探索最佳的亮丙瑞林合成反应方法。2.1 实验仪器和材料2.1.1 实验仪器 实验所需仪器如表2-1所示。上海舜宇恒平科学仪器有限公司电子天平郑州长城工贸SHB-III循环水式多用真空泵国华TBZ-82A恒温振荡器瑞江RJ-TDC-40B低速离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司）日本SHIMADZU公司LCMS-2020质谱仪日本SHIMADZU公司高效液相色谱仪SPD-10AVP紫外可变波长检测器LC-10AVTP泵表2-1 实验所需仪器表2.1.2主要材料 CTC树脂(2-Chlorotrityl chloride resin，2-氯三苯甲基氯树脂) 2；二异丙基碳二亚胺(DIC)、DIC)、HBTU、HATU、TBTU、HOBt、二异丙基乙胺(DIEA)、三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)(上海吉尔生化公司)；乙胺(Sigma公司)；二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶(Py)、哌啶(Pip)； Fmoc氨基酸脯氨酸、精氨酸、亮氨酸、D型亮氨酸、酪氨酸、丝氨酸、色氨酸、组氨酸、焦谷氨酸。2.2全保护肽片段的制备2.2.1制备前的准备（1）取三支反应器用甲醇洗净，放入烘箱烘干待用；（2）连好反应装置，保持装置的气密性，检查橡胶管的老化情况；（3）取氮气一瓶，连通好真空泵和抽滤瓶，用来收取废液 2.2.2全保护肽片段的制备步骤 （1）确定要制备的亮丙瑞林的数量，本次实验以0.3mmol为例，根据氨基酸：缩合剂：碱试剂=3:2.85:6的比例确定每次需要加入的反应物的量；（2）取已制备好的CTC树脂（取代度为0.45）3，按照所要制备的亮丙瑞林粗品的量确定要称取的树脂质量（根据树脂质量=粗品的mmol数/树脂取代度）为0.67g，称取3份，分别装入三支反应器内，贴上标签编号1 2 3；（3）将三支反应器放到装置上，用DCM浸泡20-30min，使树脂膨胀，方便后续氨基酸的连接，通入少量氮气搅拌（下文通气都是指的是通入氮气，特殊另作说明）；（4） 三个实验反应分别用不同的碱和缩合剂连接,1号反应器用HB、NMM连接，2号反应器用HOBT、DIC连接，3号反应器用HOBT、TBTU、DIEA连接；（5） 根据第一步确定的缩合剂、氨基酸量用天平称取所需质量（误差0.004g）（6） 树脂浸泡的时间满足条件后，抽出DCM，加入哌啶对载体树脂进行去保护，时间约为30min；（7） 去保护后抽出哌啶，用DMF洗涤6次后，按照反应器的顺序分别加入各个的反应物，加入碱试剂，通入氮气进行反应，一号反应器NMM反应30min，二号反应器DIC反应2h，三号反应器DIEA反应2h；（8） 反应时间到后用DMF洗涤三次后用检测管取少量树脂用检测液进行检测，待检测通过后（树脂呈现透明，检测溶液为淡黄色）方可进行下一步的去保护，不过的话则需重新称料加入反应器反应，在相同的反应条件下继续反应，直至通过；（9）对反应通过的进行去保护，条件和上述的去保护条件相同，按照肽链的氨基酸顺序重复上面的7和8步骤，直至全部连接上该条肽链的氨基酸，对最后一个连接上的氨基酸进行去保护；（10）对已经去保护的肽链先用甲醇洗一遍，再用DCM洗涤三次，然后再用甲醇洗涤两次后抽干；（11）将抽干后的粉末称重，放入离心管贴上标签和重量。2.3 全保护肽片段的切割2.3.1 全保护切割液的配置根据所称量的树脂的重量配置全保护切割液（树脂的重g：切割液ml=1:10），全保护切割液的配置为2TFA+98DCM 。本次由于树脂质量较少，配置切割液时较难配置准确，所以本次配置采取5倍量配置。切割时采取多次重复切割，减短切割时间。2.3.2 全保护的切割过程（1）将配置好的切割液按照所需要的量加入三支分别装有全保护肽片段的离心管中，用塑胶手套包扎好，放入摇床里振荡（20min），通过沙星漏斗收集滤液，待树脂抽干后装入离心管中加入切割液，继续包扎好放入摇床振荡，如此重复5次，最后弃去滤渣（被切割下来的树脂），收集好滤液；（2）将收集好的滤液放入旋转蒸发仪旋干，待到旋干时从旋转蒸发仪取出，加入自来水析出切割后的全保护肽链，放入离心机离心，重复用自来水析三次，离心后倒出上清液，得到沉淀物；（3）将沉淀物冻干后重新装管，称重，贴上标签。2.4 肽片段C-末端的乙胺化4（1）取出冻干后的全保护肽片段粉末，放入50ml的烧瓶中，加入少量DCM溶解肽片段，以完全溶解为止；（2）按照1.2倍量的比例关系，确定要称取的NHET的量，乙胺化采取用Pybop作为缩合剂，用DIEA作为碱，以HB连接好的全保护肽为例，称取的Pybop为0.17784g，NHET0.29358g，所需要的DIEA为0.126ml；（3）将NHET、Pybop加入到烧瓶中，加入DIEA，用塑胶手套封好，放入摇床里面振荡2h，充分反应；（4）反应时间到后将其从摇床里面取出，放入旋转蒸发仪上面旋干，待得旋干后取出。25肽链的侧链切割（1）切割液的配置，本次的切割液用的是E液，具体配置按照下列配置：87.5的TFA、2.5的苯酚、2.5的水、2.5的EDT、5的苯甲硫醚，将配置好的切割液振荡均匀；（2）将配置好的切割液加入到盛有肽链粉末的烧瓶中，包扎好，放入摇床中振荡切割1.5h；（3）将切割好的溶液取出，经过沙星漏斗得到滤取液，用乙醚稀释放入离心机离心（转速为2500r/min，时间为1min），倒出上清液再用乙醚洗涤三次，分别离心，最后得到沉淀物，抽干（4）装管，称重 2.7粗品分析（如图2-1所示）图2-1 粗品检测分析图 由上图可以看出制备出来的亮丙瑞林粗品的分子量符合亮丙瑞林粗品的理论分子量，可以说明该实验成功的制备合成出了亮丙瑞林粗品。2.8 HPLC分析（如图2-2，图2-3和图2-4所示）图2-2 HB成品 HPLC REPORTRankTimeName Conc.Area111.9586.251663219212.05054.765809479312.41629.843165471413.2239.16971836Total 100 10610005通过上图的HPLC检测出的结果可以看出在HB缩合剂的连接下，合成得到的亮丙瑞林粗品（成品）的纯度为54.76。 图2-3 DIEA半成品 HPLC REPORTRankTimeName Conc.Area17.76996.383892211.3922.4122101312.3161.2821116Total 100 87109通过上图可以看出的在DIEA缩合剂的连接下，合成的亮丙瑞林粗品（半成品）的纯度为96.3。图2-4 DIC半成品 HPLC REPORTRankTimeName Conc.Area17.7641.2141945227.82096.45154494837.9982.32937310Total 100 1601710通过分析，得到的亮丙瑞林粗品在DIC的连接条件下的纯度为96.45从上述的三张HPLC图分析不难看出，DIC分析得出的亮丙瑞林的纯度最高，在上述的HB、DIC、DIEA的缩合剂连接后，DIC得到的亮丙瑞林粗品的纯度最高，在相同的反应条件下面，DIC的缩合效果最好，在Fmoc合成亮丙瑞林的工艺上面，用DIC能够有效地提高收率，较多的获得亮丙瑞林粗品。收率较高，有一定的经济价值。2.9实验工艺分析上述亮丙瑞林的合成方法虽然能够很好的合成出粗品，但是由于醋酸亮丙瑞林的序列中存在Arg-Pro5，在常规条件下缩合需要大量氨基酸，而且缩合效率很低。在除去生产成本外，得到的利润较低。而微波辐射6可大幅加快化学反应速率、提高产率7，在固相肽合成中已经得到运用，可能是一种新兴的多肽合成方法，可以提高收率降低生产成本8-9。在反应的过程中，经常会有一些影响合成反应的外界因素，例如温度，通入氮气的速率等，在合成的仪器中,可以设置自动化的设备，使得反应条件能够更好的调控，在保证合成的有序进行的同时，还能够保持缩合效率和产品收率10。 参考文献1 林碧莲醋酸亮丙瑞林临床应用评价J中国处方药，2005，9(3)：232 Hoekstra W J111e 2-Chlorotrityl Resin：a worthy addition to the medical chemist s toolbopxJCurrent MedicalChemlsu3,，200l，(8)：715719。3 China C，Vilaseca M ，Giralt E，et a1An HPLCESMS stud) on the solid-phase assembly of C-terminal proline peptidesJJ Peptide Sci1999，(5)：131-1404 李佩华， 王卫国，等。应用2-氯三苯甲基氯树脂固相合成C-末端N-烷基化肽酰胺(南京工业大学制药与生命科学学院，江苏南京21000)。5 王德心，固相有机合成原理及应用指南M。北京：化学工业出版社，2004:116-117.6 张俊，岑涛等。微波作用下醋酸亮丙瑞林的固相合成。研究报告与简报，化学试剂，2009,31（6），401-404.7 蔡汉成，方云，夏咏梅，等一种新的催化方法：微波辐射酶缩合催化有机合成J有机化学，2003，23(3)：2983048 YU Hui-ming，CHEN Shui-tein，WANG Kung-tsungEnhanced coupling eficiency in solidphase peptide synthesi bymicrowave irradiationJJOrgChem，1992，57：4 7814 7849 沈树宝，王卫国，李佩华，等多肽微波固相合成法：中国，1 699 404Pj200511-2310 符友伟，吴蕾。多肽固相合成法中的3个关键点，化学工业与工程Jul.2010第27卷第4期。附录一、本文使用的部分英文字母缩写的中文对照：DMF：N,N-二甲基酰胺DCM：二氯甲烷DIC：N,N-二异丙基碳二亚胺DIEA：二异丙基乙胺NMM：N-甲基吗啡啉HATU：0-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N,N,N,N四甲基脲六氟磷酸酯HBTU：苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯HOBT：1-羟基苯骈三唑TBTU：O-苯并三氮唑- N,N,N,N-四甲基脲四氟硼酸酯HMBA：对羟基苯甲酸DMAP：4-二甲氨基吡啶TFA：三氟乙酸EDT：乙二硫醇Oall：烯丙基Alloc：烯丙氧羰基Fmoc：芴甲氧羰基Boc：叔丁氧羰基Pbf：2，2，4，6，7-五甲基-2H-苯并呋喃-5-磺酰基Trt：三苯甲基Nle：正亮氨酸Kaiser Test：茚三酮检测Pd(PPh3) 4：四（三苯基膦）钯 二、二十种常用氨基酸的分子量英文简写英文缩写中文名分子量带保护基分子量AAla丙氨酸89.1311.38CCys(Trt)半胱氨酸121.2585.7DAsp(But)天冬氨酸133.1411.46EGlu(But)谷氨酸147.1425.48FPhe苯丙氨酸165.2387.4GGly甘氨酸75.1297.3HHis(Trt)组氨酸155.2619.7IIle异亮氨酸131.2353.4KLys(Boc)赖氨酸146.2468.55LLeu亮氨酸131.2353.4MMet甲硫氨酸(蛋氨酸)149.2371.5NAsn(Trt)天冬酰胺132.1596.7PPro脯氨酸115.1337.4QGln(Trt)谷氨酰胺146.2610.7RArg(Pbf)精氨酸174.2648.77SSer(But)丝氨酸105.1383.4TThr(But)苏氨酸119.1397.5VVal缬氨酸117.1339.4WTrp(Boc)色氨酸204.2526.5YTyr(But) 酪氨酸 181.2459.5致 谢首先要感谢化学学院赵琪、韩组长的精心指导。赵老师，韩组长丰富的专业知识、严谨的治学态度、精益求精的工作作风，将对我产生深远的影响。在实验开始的前期，组长就为我们的实验设计积极的准备材料，以保证我们的实验能够及时的完成，并且督促我们去搜索相关的资料来学习，让我们在实验前就做好了充分的预习准备，这也为我们实验的顺利完成奠定了基础；在论文的初稿阶段，赵老师认真的帮助我多次修改，耐心的帮我指出其中的不足之处，所有这些，我都将铭记在心。在实验期间，感谢韩组长对我的精心指导，帮助我解决难题，帮助我能够更好地了解工艺过程，促成了我很好的完成了毕业专题。由衷的感谢韩士永组长，感谢他的精心指导，感谢他能够给我们提供这么大的一个舞台，由衷的感谢吉尔多肽公司对毕业专题的积极配合。还要感谢和我一起努力的小组成员，即孙文华，易翔等。经过我们的共同努力和共同探索，一个又一个的难题在我们的面前都迎刃而解；通过共同的分析与讨论，我们的实验才能顺利的完成。在此真诚的向你们道一声：谢谢！最后再次感谢在大学生活中给予我关心和帮助的所有老师和亲爱的同学们，感谢家人这么多年对我的养育，感谢徐州工业职业技术学院给我提供了那么多的舞台让我锻炼自己各方面的能力，祝愿学院的明天更辉煌！ 袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈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