2010CB530400-基于“肾藏精”的脏象理论基础研究.Doc

项目名称：基于“肾藏精”的脏象理论基础研究首席科学家：王拥军 上海中医药大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：国家中医药管理局 上海市科委一、研究内容1.“肾藏精”理论溯源和知识管理平台建立 对中医“肾藏精”的古今文献进行系统全面地梳理归纳，从生理、病理、诊断、治疗等方面进行理论分析；利用知识工程与知识管理的理论和方法,建立“肾藏精”脏象理论知识管理平台。 2.与肾相关疾病证候演变规律和机制研究 通过临床流行病学研究与肾相关疾病中医证型的分布特征，明确肾虚证在疾病中的分布规律；着重进行不孕不育（女子不孕症和男子不育症）、骨质疏松症、老年性痴呆和障碍性贫血（再生障碍性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血）等疾病的疗效机制和物质基础的研究。 3“肾藏精”与干细胞和NEI网络功能相关性现代生物学机制研究 在补肾填精法指导下，观察相关方药对“肾精亏虚”、“命门火衰”及“自然衰老”模型动物的作用机制以及对iPS诱导的四种成体干细胞（生殖干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、造血干细胞）增殖、分化功能的影响，探索肾精命火的生理状态和病理转化规律。4从肾论治效应验证研究 通过补肾填精法治疗，从病（证）探因，以效证因，观察“肾精亏虚”型不孕不育、骨质疏松症、老年性痴呆和障碍性贫血患者相关干细胞和NEI网络的变化，综合研究“肾藏精”在“肾主生殖”、“肾主骨”、“肾生髓”、“脑为髓之海”理论中的作用。 5. “肾藏精”脏象理论创新研究 围绕统一的目标和假说，对上述研究结果进行综合分析，建立“肾藏精”脏象理论与干细胞和NEI网络关系的新学说。二、预期目标(一)总体目标 1阐明“肾藏精”的现代生物学基础，创新和发展中医脏象理论。 2. 揭示相关疾病从肾论治临床疗效产生的内在规律和物质基础。 3揭示“肾藏精”的科学实质，创新和发展中医脏象理论。 4以“肾藏精”理论研究为示范，建立中医脏象理论研究的创新方法学体系。 5形成一支多学科交叉合作的具有较强国际竞争力的现代中医科研队伍。 （二）五年预期目标 1在中医脏象理论创新和中医基本理论研究的方法学方面取得突破。（1）完成“肾藏精”脏象理论文献和临床流行病学研究，建立数据信息库，构建知识管理平台。 （2）基本阐明“肾精”与干细胞、“命火”与NEI网络以及“肾藏精”与干细胞和NEI网络之间的关系,实现“肾藏精”理论的现代科学知识创新。 （3）基本阐明“肾精亏虚”、“命门火衰”相关疾病与干细胞和NEI网络功能失调的相关性以及“从肾论治”的规律性。 （4）在中医脏象理论研究方法学方面取得突破，实现中医脏象理论的现代创新。 2在国际有较大影响力的学术期刊上发表中医“肾藏精”相关的研究论文。发表56篇研究水平高、影响力大的中医理论研究论文。在国内核心期刊发表论文130160篇，发表SCI收录论文3050篇。出版专著45部，申报国家发明专利68项。 3形成多学科构成的中医药基础理论研究队伍，推动中医相关学科的整体发展。预期培养博士后15名，博士研究生60名，硕士研究生70名；培养高水平领军人才23名。 三、研究方案（一） 总体思路 本项目拟采用现代生物学方法，结合临床实践，深入开展“肾藏精”脏象理论的基础研究。研究的思路是，准确把握中医脏象理论的实质，在对中医学和现代医学文献理论、基础实验和临床研究进行深入审视的基础上，提出科学假说，围绕假说开展深入的探索和验证，从而得出科学的认识和结论。 肾藏先天之精，构成胚胎的原始物质（“两神相搏，合而为形，常先身生，是谓精”）；肾也藏后天之精，维持生命活动（“肾者主水，受五脏六腑之精而藏之”）。胚胎干细胞是早期胚胎中具备发育为各种组织和器官能力的全能细胞。因此，肾所藏之“精”与胚胎干细胞以及成体干细胞恰相对应。干细胞增殖与分化影响生命全过程，其平时处于沉默休眠状态，在人体修复损伤时被唤醒与激活，发挥其功能，印证了“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也”的论述。 命门之火集中体现为肾阳的功能。前期研究工作发现肾阳（命火）涵盖了全身的神经-内分泌-免疫（NEI）网络，体现为命门之火周游全身的温煦与推动作用。NEI网络确有参与促进干细胞的作用，温肾药可唤醒并激活干细胞以修复病损组织。 据此，本项目提出以下科学假说：肾精的物质基础，主要表现在干细胞；命火的功能基础，主要体现在NEI网络。肾藏精是干细胞与NEI网络功能的综合体现；补肾填精法治疗肾精亏虚、命门火衰病证，主要是通过调控干细胞和NEI网络功能而实现的。 （二） 技术途径 第一阶段：通过文献检索、数据挖掘，建立中医“肾藏精”理论数据信息库和知识管理平台。 第二阶段：通过临床流行病学研究，设计统一调查问卷，研究不孕不育、骨质疏松症、老年性痴呆和障碍性贫血的中医证型的频率分布。数据资源统一纳入数据信息库，进行综合统计分析，进一步支撑实验基础、临床验证和理论创新研究。 第三阶段：“肾藏精”与干细胞和NEI网络功能相关性研究。观察补肾填精方药对“肾精亏虚、命门火衰”及“自然衰老”模型动物的作用机制以及对iPS诱导的四种成体干细胞功能的影响，并为临床验证提供检测指标依据。 第四阶段：从肾论治效应机制研究。采用从病（证）探因和以效证因的方法，验证补肾填精法治疗与肾相关疾病的疗效机制，探索干细胞和NEI网络在“从肾论治”相关疾病中的作用规律。 第五阶段：进行相关疾病从肾论治临床疗效的物质基础研究，揭示疾病的生理学、病理学和现代生物学机制。 第六阶段：“肾藏精”脏象理论创新研究。围绕本项目的总体目标和科学假说，解决所提出的关键科学问题，完善与创新“肾藏精”脏象理论。并总结本项目研究的思路，建立脏象理论研究的方法学体系。29（三）创新点与特色 1理论创新 （1）提出肾精的物质基础主要表现在干细胞；命火的功能基础主要体现在NEI网络。“肾藏精”是干细胞与NEI网络功能的综合体现；补肾填精法治疗肾精亏虚、命门火衰病证，主要是通过调控干细胞和NEI网络功能而实现的。 （2）从“肾主生殖”、“肾主骨”、“肾生髓”、“脑为髓之海”等方面进一步证明“肾藏精”理论的实质，发展中医脏象理论。 2应用创新 （1）建立了“肾藏精“数据信息库，构建知识管理平台，形成面向基础和临床科研工作的软件系统。 （2）突出基础理论研究与临床实践的紧密结合的中医学特征，将“肾藏精”理论与临床的不孕不育、骨质疏松症、老年性痴呆和障碍性贫血的辨证、诊断、治疗紧密相连并发挥指导作用。 3方法创新 （1）应用语言工具、抽象模型工具和数学工具研究“肾藏精”理论的科学内涵；全面构建“肾藏精”脏象理论数据挖掘技术平台。 （2）多学科交叉与融合，系统研究“肾藏精”理论及其与不孕不育、骨质疏松症、老年性痴呆和障碍性贫血的内在关系，为中医脏象理论研究提供新思路，创立中医基础理论研究的新模式。 （四）可行性分析 1有中医经典理论支持与长期临床实践经验基础 中医“肾藏精”理论在内经中已有记载，是中医学的原创性理论，在长期的临床实践中得到广泛证实，并不断发展。各家学说都肯定“肾藏精”理论，并且在医书中也有大量从肾论治“不孕”“精疲”（不孕不育）、“骨痹”“骨痿”（骨质疏松症） 、“呆病”“癫症”“善忘”（老年性痴呆）、“虚劳”“血亏”（珠蛋白生成障碍性贫血、再生障碍性贫血）等医案记载。 “肾藏精”理论在难治性、复杂性疾病的治疗中发挥了十分重要的作用，这为本项目研究取得重大突破提供了雄厚的理论和实践基础。从难治性、复杂性疾病入手，在揭示“肾藏精”内在调控机制的基础上，提出解决多环节复杂病理过程的治疗理论，将会实现中医脏象理论方法学研究的突破。 2现代生物学研究方法可行 对中医“肾藏精”理论的总结、阐释与再挖掘离不开现代科技手段，随着现代生物学技术突飞猛进的发展以及观念的更新，多学科交叉、融合的实践，越来越多的现代生物学技术在“肾藏精”等中医理论研究中得到应用。 国际对干细胞研究的关注也为本项目带来很大机遇，国内外研究也认识到“肾藏精”的部分生物学基础。本项目中沈自尹院士领导的课题组以“NEI网络”学说为切入点，几十年的工作基础揭示了中医“肾”脏象理论的现代科学内涵，近年又证实补肾药（淫羊藿总黄酮）能够促进肾上腺皮质外侧区域干细胞的增殖，并能使皮质干细胞向肾上腺皮质功能成熟层迁移。这些研究有力地支持了本项目提出的科学假说，有力地推动了中医“肾藏精”理论科学实质的研究。3研究队伍多学科交叉，科研力量雄厚 有多个全国中医临床研究研究基地、国家重点学科、国家重点实验室、国家工程技术中心、国家中医药管理局重点研究室、国家中医药管理局重点专病专科、国家中医药管理局三级实验室等支撑。前期研究基础扎实，团队主要成员是本领域国内外著名学者，为本项目的研究奠定了良好的前期工作基础。 项目的承担单位均在中医脏象相关理论领域和难治性、复杂性疾病的中医药防治领域进行过深入的研究，具有深厚的前期工作基础和完善的仪器设备及技术条件。 项目研究队伍由老中青三代优秀科学家组成，是一支多学科交叉、结构合理、具有国际竞争力的创新团队。各课题负责人及学术骨干是包括中国科学院院士在内的相关领域资深专家，具有丰富的科研经验和理论与临床实践，有承担国家重点、重大项目的实践经验，这为本项目研究取得重大突破提供了深厚的研究基础及坚实的保障。 王拥军教授作为拟申请项目的首席科学家，是国家杰出青年科学基金获得者，国家卫生部有突出贡献中青年专家，国家教育部新世纪优秀人才，国家人事部新世纪百千万人才工程国家级人选，全国第二届百名杰出青年中医。担任国家科技部科技成果、国家自然科学基金委员会（通讯和会议评审）、国家教育部、国家科技部、国家卫生部评审专家以及国家中医药管理局中医药科技咨询与评审专家。具有较好的总体组织和协调能力，具有宏观的科学研究视野。 （五）课题设置课题1 ： “肾藏精”理论文献与临床信息综合分析研究研究内容1.“肾藏精”理论相关文献的研究（1）以中医药古籍文献和当代国内外文献为研究对象，全面收集，采用文献整理和数字化分析研究相结合的方法，规范中医名词术语，确立符合“肾藏精”理论辨证论治和现代科学认知规律的构成要素（包括疾病、证候、治法、方剂、中药等）及表征要素，明确各要素的属性。（2）“肾藏精”脏象理论溯源研究：包括阴阳学说、五行学说、天人相应学说对中医肾精命火脏象理论的影响。（3）“肾藏精”脏象理论基本概念、原理和演变规律研究：包括相关基本概念内涵与外延、解剖形态、生理功能与病理状态、脏象内在系统联系、体质类型以及相关现代生物学参数研究。（4）“肾藏精”脏象理论相关疾病与证候的基本原理与规律研究：包括中医肾精命火脏象理论相关疾病与证候的病因病机、临床表征信息、辨证论治依据、古代病案分析、现代文献计量学研究。（5）“肾藏精”脏象理论相关疾病的治则治法研究；相关的方剂、中药研究；“治未病”原则和方法学研究。2.“与肾相关”疾病临床流行病学调查研究 以不孕不育、骨质疏松症、老年性痴呆和珠蛋白生成障碍性贫血等“与肾相关”疾病为研究对象，全面收集中西医相关文献，从病因病机、证候特征、治则治法、疗效机理等方面进行全面系统整理和挖掘，建立证候学分析技术路线，开展基于临床流行病学方法的“与肾相关”疾病的特征分析，研究其基本规律。3. 本项目系列课题研究结果的综合数据信息库建立（1）“肾藏精”脏象理论相关病证临床疗效内在规律研究的综合信息数据库。包括从肾论治不孕不育、骨质疏松症、老年性痴呆、珠蛋白生成障碍性贫血的研究成果，目前相关的临床研究方案及其评价，至今为止相关的方法学研究及其评价，结合本项目临床研究及实验研究数据进行总结。（2）“肾藏精”脏象理论相关病证基础实验研究综合信息数据库。包括各疾病实验动物模型与NEI网络调节和干细胞的研究。4. 中医“肾藏精”理论知识管理平台“肾藏精”脏象理论的知识管理平台处理的数据、知识库的建立与完善、知识管理平台的建立。预期目标1应用文献计量学、理论分析方法，全面、系统获取“肾藏精”文献资料进行理论分析，诠释中医肾精命火脏象理论，阐明其理论的基本科学内涵；2应用调查研究和临床流行病学调查等方法，揭示相关疾病、证候从肾论治临床疗效产生的内在规律；3将获取的“肾藏精”研究的数据和信息，分析、归纳、集成为结构性知识，通过数据挖掘，构建“肾藏精”理论的数据信息库和知识管理平台，4建立以国家重点学科为基础的创新人才团队，培养国家高层次理论研究学术带头人1-2名、学术骨干8-10名、博士研究生6-8名、硕士研究生8-10名；5. 出版学术专著3部：中医“肾藏精”脏象理论、从肾论治的治则治法和方剂中药、 基于“肾藏精”的养生康复理论；6）发表高水平理论及其方法学研究论文18-20篇。经费比例： 14.29% 承担单位： 辽宁中医药大学、天津中医药大学 课题负责人： 吕爱平 参加人员：郑洪新、孟静岩、才丽平、李敬林、于春泉、王惠君、尚德阳课题2 ： “肾藏精”理论与干细胞和NEI网络相关性的研究研究内容根据中医经典理论，肾精盛衰主宰了人体生、长、壮、老的全过程，随着年龄增长，肾精出现亏损；以药测证是研究中医脏象理论的重要方法，通过药物的作用机制可探索证的特殊内涵。本课题即在上述两种基本策略的基础上，采用不同月龄段大鼠及肾阳虚大鼠模型，并用补肾药物干预，观察补肾改善肾精亏虚以及激活内源性干细胞（包括神经干细胞、骨髓间充质干细胞等）的效果及机制，从而部分揭示肾藏精的脏象理论内涵研究。进而，在体外模型，研究补肾药物对神经干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞及诱导多能干细胞自我更新、多系分化的影响以及机制。综合体内外研究，为补肾药物激活内源性干细胞，为肾精的现代科学内涵提供依据。1. 补肾填精法改善自然衰老大鼠肾精亏虚与激活内源性干细胞的研究采用不同月龄段SD大鼠（4、8、18、24月），对24月龄大鼠采用淫羊藿苷、淫羊藿总黄酮进行干预3个月，每组15只。（1） 观察补肾药物改善肾虚的效果：检测补肾干预的老年大鼠认知功能、骨密度等的影响。（2） 观察补肾药物激活内源性干细胞的效果及机制： 提取骨髓间充质干细胞（MSCs）细胞，研究MSCs自我更新、定向分化的增龄性改变及补肾药物的干预作用；采用大鼠Affymetrix全基因组基因芯片，比较不同年龄段及补肾药物干预后MSCs mRNA表达的差异，明确MSCs自我更新、分化谱、增殖/分化平衡增龄改变的分子机制，并深入鉴定。对文献报道的影响骨髓间充质干细胞分化的重要通路逐一进行研究。 观察神经干细胞（NSCs）自我更新、定向分化的增龄性改变及补肾药物的干预作用；采用大鼠Affymetrix全基因组基因芯片，比较不同年龄段及补肾药物干预后NSCs mRNA表达的差异，明确NSCs自我更新、分化谱、增殖/分化平衡增龄改变的分子机制，并深入鉴定。对文献报道的影响神经干细胞分化的重要通路逐一进行研究。（3） 检测神经内分泌免疫相关指标，明确补肾药物激活内源性干细胞的神经内分泌免疫途径：取血，检测神经内分泌免疫相关指标。（4） 总结补肾药物改善肾虚和激活内源性干细胞的关系，并明确发挥作用的主要神经内分泌机制。2. 补肾填精法改善肾阳虚大鼠肾精亏虚与激活内源性干细胞的研究采用皮质酮肾阳虚大鼠模型，并用补肾药物淫羊藿苷、淫羊藿总黄酮进行干预，每组15只。（1） 观察补肾药物激活内源性干细胞的效果及机制： 提取骨髓间充质干细胞（MSCs）细胞，研究MSCs自我更新、定向分化的改变及补肾药物的干预作用；采用大鼠Affymetrix全基因组基因芯片，比较各组MSCs mRNA表达的差异，明确MSCs自我更新、分化谱、增殖/分化平衡增龄改变的分子机制，并深入鉴定。对文献报道的影响骨髓间充质干细胞分化的重要通路逐一进行研究。 观察神经干细胞（NSCs）自我更新、定向分化的改变及补肾药物的干预作用；采用大鼠Affymetrix全基因组基因芯片，比较各组NSCs mRNA表达的差异，明确NSCs自我更新、分化谱、增殖/分化平衡改变的分子机制，并深入鉴定。对文献报道的影响神经干细胞分化的重要通路逐一进行研究。（2） 检测神经内分泌免疫相关指标，明确补肾药物激活内源性干细胞的神经内分泌免疫途径：取血，检测神经内分泌免疫相关指标。（3） 总结补肾药物改善肾虚和激活内源性干细胞的关系，并明确发挥作用的主要神经内分泌机制。3体外研究补肾药物激活神经干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎及诱导多能干细胞的效果及机制。（1） 神经干细胞通过自我更新扩增干细胞池，并能分化为神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞。在充分鉴定神经干细胞的基础上，研究补肾药物对神经干细胞自我更新的影响；分别利用上述三种终末细胞的标志物，观察淫羊藿苷、淫羊藿总黄酮对神经干细胞分化的作用。采用大鼠Affymetrix全基因组基因芯片，研究药物干预前后相关基因表达的变化，筛选补肾药干预神经干细胞自我更新、分化谱、增殖/分化平衡改变的分子机制和通路，并深入鉴定。对文献报道的影响神经干细胞分化的重要通路逐一进行研究。（2） 骨髓间充质干细胞通过自我更新补充数量，并能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化，也有报道能向神经细胞、呼吸道上皮细胞跨胚层分化。本项目拟观察上述药物对骨髓间充质干细胞自我更新、分化的影响。采用大鼠Affymetrix全基因组基因芯片，研究药物干预前后相关基因表达的变化，筛选补肾药干预骨髓间充质干细胞自我更新、分化谱、增殖/分化平衡改变的分子机制和通路，并深入鉴定。对文献报道的影响骨髓间充质干细胞分化的重要通路逐一进行研究。（3） 胚胎干细胞及诱导多能干细胞具有分化的全能特性，是研究干细胞分化的较好模型。国外已报道胚胎干细胞向神经干细胞、成骨细胞、造血干细胞、胰岛细胞的定向分化。本项目拟观察上述药物对胚胎干细胞及诱导多能干细胞定向分化的影响。采用大鼠Affymetrix全基因组基因芯片，研究药物干预前后相关基因表达的变化，筛选补肾药干预胚胎干细胞及诱导多能干细胞定向分化的分子机制和通路，并深入鉴定。（4） 综合体内外研究结果，总结补肾药物激活内源性干细胞的主要神经内分泌免疫途径，细胞内主要信号通路，从而揭示肾精命火的现代科学内涵。预期目标1. 明确补肾药物改善自然衰老大鼠的效果和激活内源性干细胞的关系；明确补肾药物发挥作用的主要神经内分泌免疫途径和细胞内分子机制。2. 明确补肾药物激活肾阳虚大鼠内源性干细胞的效果；明确补肾药物发挥作用的主要神经内分泌免疫途径和细胞内分子机制。3. 通过上述的以药测证以及机制的深入研究，为肾精命火的中医理论提供现代生物学意义上的解释，升华中医“肾藏精”理论。4. 培养一批高层次的中医和中西医结合研究型人才，培养研究生10-20名，增强各科研单位的协作能力，提高承担中医重大科研课题的能力。5. 发表论文20-30篇。其中被SCI收录5篇以上，申请专利1项。经费比例： 19.05% 承担单位： 复旦大学、湖南中医药大学 课题负责人： 沈自尹 参加人员： 刘柏炎、卞琴、张新民、黄建华、丁道芳、谭琥、屈波课题3 ： 从不孕不育探讨“肾主生殖”理论的研究研究内容1.基于肾藏精的温肾填精方药治疗不孕不育的数据管理平台研究（1）配合课题一的流行病调查研究（不孕不育与肾精不足、命门火衰证候体质相关的流行病学调查）及本课题实验及临床研究数据处理的需要研制结构化数据采集软件。（2）通过本课题相关古籍文献梳理及现代研究数据挖掘，在本课题实验数据管理基础上，建立温肾填精方药干预生殖的实验研究数据库。（3）通过“肾精亏虚、命门火衰”型不孕不育患者临床四诊信息采集、精子质量及活性、卵泡成熟及排出、子宫卵巢血供指数、盆腔热代谢值动态评价、细胞体液免疫、免疫因子等多源数据采集及临床研究数据，建立温肾填精方药治疗不孕不育的临床数据研究数据库。2. 基于肾藏精的温肾填精方药促进生殖的实验研究（1）基于HPLC的温肾填精复方、单味药及单体含药血清制备研究。应用HPLC技术制备温肾填精复方（右归丸、五子衍宗丸等）、单味药及单体（淫羊藿、补骨脂、淫羊藿苷、淫羊藿总黄酮、补骨脂素、异补骨脂素等）含药血清以应用于体外筛选研究及体外药效机制研究。（2）温肾填精方药及单体成分干预生殖的3T3-L1、黄体颗粒细胞体外药效评价筛选研究。选择3T3-L1前脂肪细胞株、超排卵所得的原代培养鼠颗粒细胞，应用HPLC技术制备的含药血清对3T3-L1前脂肪细胞、鼠颗粒细胞进行培养，通过观察各药物含药血清对3T3-L1前脂肪细胞、鼠颗粒细胞生长发育、激素分泌、芳香化酶表达等情况，在筛选有效的温肾填精方药、单味药及单体成分基础上进行本课题实验及临床研究。（3）温肾填精方药促胚胎干细胞定向分化为卵母细胞及精原细胞研究。首先收集似干细胞的克隆、用免疫细胞学分析胚胎干细胞标志蛋白鉴定干细胞克隆，通过温肾填精药物干预，观察对胚胎干细胞分化发育的影响。（4）温肾填精方药促进生殖细胞生长发育及其机制研究。选择未成熟卵细胞、成熟卵细胞、受精的成熟卵细胞、受精卵，应用免疫组化及激光共聚焦显微技术观察温肾填精方药含药血清对未成熟卵细胞生长发育、体外受精和胚胎发育的影响。（5）温肾填精方药对胚胎着床微环境的影响研究。通过建立超促排卵周期和自然周期胚胎受体小鼠模型，通过比较妊娠率和胚胎着床率，盆腔热代谢及子宫内膜整合素v3表达情况研究温肾填精方药对胚胎着床微环境的影响。（6）温肾填精方药对冷冻卵细胞、精子、受精卵解冻复苏的干预研究。采用程序冷冻方法，用温肾填精方药含药血清配制的冷冻保存液和解冻液，冷冻保存小鼠精子、卵细胞、胚胎和卵巢组织，通过透射电镜、共聚焦显微镜、免疫组化等方法评价温肾填精方药对冷冻精子、卵细胞、受精卵解冻复苏的干预。3. 基于肾藏精的温肾填精方药促进生殖的临床研究（1）基于热成像技术的温肾填精方药调节肾精不足、命门火衰证的客观化研究。采用单中心或多中心、随机、平行对照的临床实验设计，分为正常女性组、正常男性组、女性肾精不足、命门火衰不孕组、男性女性肾精不足、命门火衰不育组，应用热成像技术评价右归丸、五子衍宗丸对受试者全身及局部细胞代谢热值的动态影响及规律。（2）温肾填精方药调节NEI网络治疗不孕症的临床研究。采用单中心或多中心、随机、平行对照的临床实验设计，分别对NEI功能失调不孕及IVF患者进行评价研究。NEI功能失调不孕分为观察及对照组，对照组为腹腔镜分粘术后患者，观察组在上述干预上加用温肾填精中药，观察温肾填精方药对免疫功能失调性不孕干预作用。IVF患者也分为对照组与观察组，对照组给予西医促排卵药物，治疗组在上述基础上给予右归丸和五子衍宗丸加减，观察温肾填精方药对IVF妊娠结局的影响。（3）温肾填精方药调节少精弱精不育症精子数量及活性的临床研究。采用单中心或多中心、随机、平行对照的临床实验设计，分为观察及对照2组，对照组给予左卡尼汀，治疗组给予右归丸和五子衍宗丸加减，评价温肾填精方药对精子的数量及活性的影响。选取30份不同男性的精液标本洗涤优选后，分为温肾填精中药干预组及对照组，分别与不同浓度的PKA于37共同孵育，评价不同浓度蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA）参与调节精子的活力的影响、筛选出PKA对体外精子活力影响的最佳时间和浓度、初步探讨PKA影响精子活力的机制。预期目标1.建立不孕不育信息管理平台，研制出结构化数据采集软件，建立不孕不育的实验及临床数据库。2.明确温肾填精法治疗不孕不育的证治规律，揭示“肾主生殖”与不孕不育临床疗效的内在联系，深化从肾论治不孕不育的理论意义。3.明确温肾填精药产生疗效与胚胎干细胞、生殖干细胞、干预胚胎着床及NEI网络功能的相关性。4.通过上述的从病（证）探因、以效证因，以及机制的研究，为肾藏精、肾主生殖的中医理论提供现代生物学意义上的解释，升华中医“肾藏精”理论。5.培养一批高层次的中医和中西医结合研究型人才，培养研究生19-28名，其中博士研究生3-6名，增强各科研单位的协作能力，提高承担中医重大科研课题的能力。6.发表论文20-34篇，其中被SCI收录5篇以上，撰写专著1部。7.申请专利2项，获专利授权1项。经费比例： 14.29% 承担单位： 成都中医药大学、北京中医药大学 课题负责人： 陆华 参加人员： 李曰庆、王米渠、王彬、刘伟信、杨丹、朱明辉、胡翔课题4 ： 从骨质疏松症探讨“肾主骨”理论的研究研究内容1. 补肾填精法治疗骨质疏松症的证治规律研究 （1）多源信息采集平台的建立。基于骨质疏松症患者的临床表现，建立中医四诊信息的临床证候量表。研制结构化数据采集软件，在SOP指导下完成采集临床病例资料，形成临床数据信息库，数据纳入课题一统一分析。 （2）临床疗效评价研究。 选择临床65-75岁女性原发性骨质疏松症患者，中医辨证属于肾精亏虚型。ANOVA方差分析和2检验各组患者在年龄、性别和体重上差异无显著性。测定部位为L2-4前后位和Ward氏三角BMD，BMD经年龄和体重指数（body mass index，BMI）校正后得到校正值BMDadj，BMD -2.5SD为骨质疏松症。正常组L2-4 BMD-2.5SD，对照组自愿接受福善美治疗，治疗组自愿接受青娥丸合二仙汤治疗。每组均为60例，治疗6个月。 通过中医证候积分、骨质疏松症相关评价量表、骨密度（BMD）及影像学特异性表现等检测手段，评价补肾填精法治疗骨质疏松症的疗效，揭示其产生疗效的物质基础。通过长期随访量表评价及终点事件调查，评价该法治疗骨质疏松症的远期疗效。阐述补肾填精法治疗骨质疏松症的证治规律，揭示“肾主骨”与骨质疏松症临床疗效的内在联系，深化从肾论治骨质疏松症的理论意义。2补肾填精法治疗骨质疏松症的物质基础研究 （1）骨代谢指标检测。包括骨合成代谢指标：OC、I型胶原前胶原氨基端前肽（N-terminal propeptide of type procollagen, PINP）、骨碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，bALP）；骨分解代谢指标：CTX和NTX（I型胶原端肽交联）。（2）骨质疏松症患者NEI网络指标检测。健康志愿者为正常组，青娥丸合3二仙汤为治疗组，福善美为对照组，每组的样本量15例。抽取外周血，进行“NEI网络”指标检测。 （3）骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞功能研究。分组和治疗同上。骨髓穿刺，分离纯化，进行骨髓间充质干细胞分子标志鉴定（Runx2，type I collagen，OP，osteonectin， OC，BSP，ALP等），揭示补肾填精法影响骨髓间充质干细胞的环节及促成骨的作用。采用人Affymetrix全基因组基因芯片检测mRNA表达，筛选并鉴定药物干预骨髓间充质干细胞的关键基因和分子通路。3. 补肾填精法治疗骨质疏松症的疗效机制研究 （1）动物模型建立。选择去双侧卵巢大鼠骨质疏松模型，在疾病模型建立的基础上，再建立肾阳虚型大鼠骨质疏松病证结合模型邝安堃，吴裕，丁霆，等某些助阳药对于大剂量皮质激素所致耗竭现象的影响中华内科杂志，1963，2(2)：113。随机分为正常对照组、模型组、青娥丸合二仙汤治疗组、福善美对照组，每组20只动物。 （2）相关指标检测。骨密度及生物力学指标检测：取四肢骨、椎体、椎间盘等。双能X线骨密度仪（DEXL）、Micro-CT进行椎体及全身BMD测定；万能材料试验机检测股骨三点弯曲生物力学指标。组织形态学观察：取下丘脑、垂体、肾脏、肾上腺、胸腺、卵巢、子宫、睾丸、四肢骨、椎体、椎间盘、血细胞等组织器官，进行组织形态学观察：生化指标测试：ELISA检测大鼠BUN、Scr、ALP、PTH、BGP、Dpd等肾功能相关指标的影响，并深入探讨IL-6、TGF-），揭示“肾藏精，主骨生髓”在原发性骨质疏松症中的生物学机理。 （3）NEI相关指标检测。每组10只动物，取材和检测同课题二NEI部分，以明确补肾填精法干预NEI网络治疗骨质疏松症的环节。 （4）骨髓间充质干细胞相关指标检测。抽取骨髓，进行分子标志鉴定。检测向成骨分化的标志物，包括：Runx2，type I collagen，OP，osteonectin， OC，BSP，ALP等，评价骨髓间充质干细胞分化能力。采用大鼠Affymetrix全基因组基因芯片检测mRNA表达，筛选并鉴定药物干预骨髓间充质干细胞的关键基因和分子通路。预期目标1. 建立骨质疏松症多源信息采集平台，研制出结构化数据采集软件，形成关于骨质疏松的临床数据信息库。2. 明确补肾治疗骨质疏松症的近期及远期疗效，阐述补肾填精法治疗骨质疏松症的证治规律，揭示“肾主骨”与骨质疏松症临床疗效的内在联系，深化从肾论治骨质疏松症的理论意义。3. 明确骨质疏松症与骨髓间充质干细胞生物学行为的关系，在此基础上，明确补肾药产生疗效与干预干细胞的生物学行为的相关性。4. 大量研究已经表明NEI网络是补肾药物作用的重要途径，研究也表明NEI网络的物质能调节干细胞的行为，因此通过本项目的研究拟明确补肾药是否通过以及通过何种NEI网络途径调节干细胞行为，从而产生临床疗效。5. 通过上述的从病（证）探因、以效证因，以及机制的研究，为肾藏精、肾主骨的中医理论提供现代生物学意义上的解释，升华中医“肾藏精”理论。6. 培养一批高层次的中医和中西医结合研究型人才，培养研究生10-20名，增强各科研单位的协作能力，提高承担中医重大科研课题的能力。7. 发表论文20-30篇。其中被SCI收录5篇以上，申请专利1项。经费比例： 23.80% 承担单位： 上海中医药大学、辽宁中医药大学 课题负责人： 王拥军 参加人员： 施杞、任艳玲、周重建、莫文、周泉、唐得志、崔学军、李佶课题5：从老年性痴呆探讨“肾生髓，脑为髓之海”理论的研究研究内容1补肾填精法治疗老年性痴呆临床疗效评价研究开展多中心、随机、平行对照临床试验。通过中医证候积分、老年性痴呆相关评价量表、影像学特异性表现等检测手段，评价补肾填精法治疗老年性痴呆的临床疗效；通过长期随访量表评价及终点事件调查，评价该法治疗老年性痴呆的远期疗效，以阐释补肾填精法治疗老年性痴呆肾虚证的证治规律，揭示“肾生髓，脑为髓海”与老年性痴呆临床疗效的内在联系，深化从肾论治老年性痴呆的临床指导意义。2补肾填精法治疗老年性痴呆的物质基础研究（1）血浆特异性蛋白表达等相关指标检测。（2）老年性痴呆患者“NEI网络”相关指标检测。3补肾填精法治疗老年性痴呆的疗效机制研究（1）动物模型建立。选择不同月龄快速老化鼠（SAM-P/8鼠），在此基础上，建立肾阳虚型大鼠老年性痴呆病证结合模型。（2）相关指标检测。动物行为学（认知功能及记忆能力）检测；不同部位脑组织形态学观察；特异性基因与蛋白表达检测，揭示“肾生髓，脑为髓海”理论在老年性痴呆中的生物学机理。（3）“NEI网络”相关指标检测。选取与老年性痴呆密切相关的NEI指标，利用基因芯片等技术方法，以明确补肾填精法干预NEI网络治疗老年性痴呆的环节。（4） 神经干细胞相关指标检测。通过神经干细胞鉴定分子标志检测神经干细胞数量，并分离出神经干细胞；通过向神经相关细胞分化的标志物评价干细胞分化能力。预期目标1明确补肾治疗老年性痴呆的近期及远期疗效，阐述补肾填精法治疗老年性痴呆的证治规律，揭示“肾生髓，脑为髓海”与老年性痴呆临床疗效的内在联系。2明确补肾治疗老年性痴呆的物质基础，阐述补肾填精法治疗老年性痴呆肾虚证的临床作用机理，深化从肾论治老年性痴呆的理论意义3明确老年性痴呆与神经干细胞生物学行为的关系，在此基础上，明确补肾药产生疗效与干预干细胞的生物学行为的相关性。4大量研究已经表明NEI网络是补肾药物作用的重要途径，研究也表明NEI网络的物质能调节干细胞的行为，因此通过本项目的研究拟明确补肾药是否通过以及通过何种NEI网络途径调节神经干细胞行为，从而产生临床疗效。5通过上述的从病（证）探因、以效证因，以及机制的研究，为肾藏精、肾生髓，脑为髓海的中医理论提供现代生物学意义上的解释，升华中医“肾藏精”理论。6培养一批高层次的中医和中西医结合研究型人才，培养研究生10-15名，增强各科研单位的协作能力，提高承担中医重大科研课题的能力。7发表论文15-20篇，其中被SCI收录2篇以上。经费比例： 14.29% 承担单位： 天津中医药大学、上海中医药大学 课题负责人： 张玉莲 参加人员： 林水淼、周震、安红梅、郑锦、周永明、顾耘、郭家奎课题6 ： 从障碍性贫血探讨“肾生髓”理论的研究 研究内容1补肾益髓法治疗珠蛋白生成障碍性贫血证治规律研究 （1）多源信息采集平台的建立。基于珠蛋白生成障碍性贫血的临床表现，建立中医四诊信息的临床证候量表；调查患者中医症候与基因突变型（遗传背景与先天禀赋）关系，建立血液参数疗效性指标（Hb、RBC、Ret、HbF）等信息采集系统。研制结构化数据采集软件，在SOP指导下完成采集临床病例资料，形成临床数据信息库，数据纳入课题总项目统一分析。 （2）中药治疗珠蛋白生成障碍性贫血临床验证。通过3位中医师临床辨证，选取符合纳入标准的（肾精亏损型）中间型b-珠蛋白生成障碍性贫血患者为研究对象，在益髓生血颗粒前期疗效基础上，采用补肾益髓方（仙灵脾，补骨脂，山茱萸，熟地，阿胶，当归），设置正常组，安慰剂对照，补肾益髓方治疗组，和益髓生血颗粒对照组，每组各25例。开展随机、平行对照临床试验，评价中药治疗b-珠蛋白生成障碍性贫血的临床有效性，验证从肾论治珠蛋白生成障碍性贫血的有效性。2补肾益髓法治疗b-珠蛋白生成障碍性贫血生物学物质基础研究 （1）补肾益髓法对b-珠蛋白生成障碍性贫血红细胞形态与免疫功能影响：以b-珠蛋白生成障碍性贫血患者为研究对象，每组选取10例患者，采用透射电镜、real-time PCR、ELISA、红细胞CR1花环(RBC-CRIR)试验等技术，从患者血液参数、红细胞形态、红细胞膜骨架蛋白、红细胞包涵体、红细胞氧化损伤、红细胞分子免疫功能等不同层面，探讨补肾益髓法治疗障碍性贫血的物质基础。（2）补肾益髓法对b-珠蛋白生成障碍性贫血患者珠蛋白表达调控研究：以b-珠蛋白生成障碍性贫血患者为研究对象和样品来源，每组选取810例患者，从AHSP mRNA表达、b-珠蛋白表达调控与甲基化修饰、差异基因表达、功能蛋白表达、血清多肽谱等方面，研究补肾益髓法治疗珠蛋白生成障碍性贫血的分子机制。（3）补肾益髓法对珠蛋白生成障碍性贫血患者NEI网络的影响：每组样本量10例。进行神经内分泌免疫系统网络（NEI网络）相关指标的检测：ACTH、血浆皮质醇、b-内啡肽、生长激素、雌二醇、睾酮、儿茶酚胺、乙酰胆碱、血管活性肠肽、促甲状腺素 TSH；流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+细胞比例，计算CD4+/CD8+之比；取血清，检测IL-2、IFN-、TGF、IL-1浓度。（4）补肾益髓法对珠蛋白生成障碍性贫血患者干细胞增殖分化的影响：基于b-珠蛋白生成障碍性贫血患者在体干细胞培养，研究补肾益髓中药对造血干细胞的影响。每组样本量10例，探讨治疗前后部分患者骨髓造血干细胞增殖活性、分化趋势及相关转录因子水平的改变，采用人Affymetrix全基因组基因芯片检测mRNA表达，筛选并鉴定药物干预骨髓间充质干细胞的关键基因和分子通路。3补肾益髓中药有效组分对红细胞分化和g-珠蛋白基因活化的作用及机制的研究：利用转人b-珠蛋白基因簇大鼠红白血病稳定细胞系，从转录因子表达、细胞内信号通路、表观遗传修饰（重点分析DNA甲基化）三个不同层面上深入研究益髓生血颗粒活化b-影响b-类珠蛋白基因表达的机制。 （1） 研究补肾益髓中药有效组分对珠蛋白基因开关的影响和机制1）利用转人b-珠蛋白基因簇大鼠红白血病（MEL）稳定细胞系研究中药有效组分对于人g-和b-珠蛋白基因表达和开关的影响。2）利用大鼠MEL细胞系研究中药有效组分对珠蛋白基因表达和开关（主要研究胚胎到成鼠珠蛋白表达开关）的影响。3）研究中药有效组分对人CD34+造血干/祖细胞红系诱导培养过程中珠蛋白基因表达和开关的影响（主要研究胚胎e-到胎儿g-以及胎儿到成人b-珠蛋白基因表达的开关，重点实验中药有效组分是否具有对e-和g-基因的特异活化作用。4）在上述研究获得正性结果的基础上，研究中药有效组分影响珠蛋白基因开关以及特异活化e-和g-珠蛋白基因的机制（重点实验转录因子的表达变化以及表观遗传改变等）。5）在获得正性结果的基础上，选择性实验用中药有效组分治疗b-地中海贫血患者前后相关基因表达的变化以及与治疗效果的关系。（2）研究中药有效组分对造血细胞分化（重点在红系分化）的影响和机制1）利用半固体培养基研究中药有效组分对造血干细胞（HSC）向红系分化定向的影响2）利用CD34+造血干/祖细胞红系诱导液体培养研究中药有效组分对红系分化的影响。3）在上述研究获得正性结果的基础上，研究中药有效组分影响HSC红系定向和红系祖细胞继续分化成熟的作用机制（重点实验可能影响红系分化的蛋白质基因以及miroRNAs的表达变化，并进一步研究影响红系分化的调节网络。）4）在获得正性结果的基础上，选择几个病例，实验中药有效组分对b-地中海贫血患者红系分化的影响以及相关基因表达的影响。4. 研究补肾益髓中药及其有效组分对再生障碍性贫血大鼠动物模型的影响：建立再生障碍性贫血动物大鼠模型（模型一：60Co-g射线3.0 Gy照射后第4d开始给予环磷酰胺50.0 mgkg-1及氯霉素62.5 mgkg-1，共3d；模型二：马利兰0.05%混悬液按4mlkg-1d，连续灌胃45天，造模诱导），给予补肾益髓中药干预治疗，观察外周血象、骨髓有核细胞及免疫功能指标变化，同时观察药物对障碍性贫血模型大鼠NEI相关指标变化，并分离造血干细胞，观察再障大鼠骨髓红系干细胞增殖分化和相关生长因子的变化。预期目标总体研究目标：以珠蛋白生成障碍性贫血为研究对象，从证探因，以法验效，补肾益髓中药治疗珠蛋白生成障碍性贫血的临床疗效与调控造血干细胞和NEI网络功能的相关性，进一步揭示“肾生髓”理论的科学内涵。在以往基础上，按照循证医学原则，以珠蛋白生成障碍性贫血患者为主要研究对象，在广西地中海贫血症高发区应用补肾益髓中药治疗地中海贫血症，采用随机、单盲、安慰剂对照临床规范研究，结合转人b-珠蛋白基因簇大鼠红白血病体外细胞模型和再生障碍性贫血大鼠模型，通过临床和实验研究，从激活g-基因；影响基因开关；调控珠蛋白mRNA表达；调控骨髓干细胞诱导分化、促进有效红细胞生成，对转人b-珠蛋白基因簇大鼠红白血病稳定细胞系干细胞诱导等不同层面，探索补肾益髓法治疗障碍性贫血的临床疗效与调控造血干细胞和NEI网络功能的相关性。五年预期目标：（1） 建立b-珠蛋白生成障碍性贫血症多元信息采集平台：建立中医四诊信息临床证候量表；中医症候与基因突变型关系量表及血液学参数疗效性指标信息采集系统，研制出结构化数据采集软件，在SOP指导下形成关于珠蛋白生成障碍性贫血的临床数据信息库。（2） 完成200例珠蛋白生成障碍性贫血患者证候规律、遗传背景关系调查，完成200例临床患者流行病学调查统计分析，筛选符合条件的研究病例；（3） 完成高发区符合纳入条件的珠蛋白生成障碍性贫血症患者采集，随机分为正常组，安慰剂对照，补肾益髓方治疗组，和益髓生血颗粒对照组，每组各25例，开展中药治疗对照临床规范研究，完成80例（考虑到可能脱落病例，增加5例患者）珠蛋白生成障碍性贫血患者临床有效性评价；（4） 初步揭示中药治疗珠蛋白生成障碍性贫血症对患者g-珠蛋白基因活化与表达调控的分子机制；（5） 初步揭示中药治疗珠蛋白生成障碍性贫血症对患者红细胞形态结构与免疫功能影响的分子机制；（6） NEI网络是补肾药物作用的重要途径，研究表明NEI网络的物质能调节干细胞的行为。通过本课题研究，初步揭示中药是否通过以及通过何种NEI网络途径调节珠蛋白生成障碍性贫血症患者骨髓造血干细胞行为，从而产生临床疗效； （7） 初步揭示中药及其有效组分对珠蛋白生成障碍性贫血症患者治疗前后，对骨髓造血干细胞活性、增殖分化及相关转录因子表达水平的影响；（8） 利用转人b-珠蛋白基因簇大鼠红白血病稳定细胞系的体外细胞学研究，从转录因子表达、细胞内信号通路、表观遗传修饰（重点分析DNA甲基化）三个不同层面上深入研究益髓生血颗粒活化b-影响b-类珠蛋白基因表达的机制。（9） 利用再生障碍性贫血动物模型进行动物学实验研究，初步揭示补肾益髓中药干预NEI网络、调控干细胞诱导分化，治疗再生障碍性贫血模型大鼠的疗效作用机制；（10） 通过上述的从病（证）探因、以效证因，以及机制的研究，为肾藏精、肾生髓的中医理论提供现代生物学意义上的解释，升华中医“肾藏精、肾生髓”理论深刻内涵；（11） 培养一批高层次的中医和中西医结合研究型人才，培养研究生810名，增强各科研单位的协作能力，提高承担中医重大科研课题的能力；（12） 发表论文25-30篇，其中被SCI收录58篇以上。申请专利1项；撰写专著1部。经费比例： 14.29% 承担单位： 中国中医科学院广安门医院、北京中医药大学 课题负责人： 吴志奎参加人员：方素萍、赵宗江、张新华、杜占文、刘咏梅、王文娟、李敏（六）课题间关系课题1是理论文献和临床流行病学研究，诠释中医肾精命火脏象理论，梳理其基本内涵与发展脉络，建立数据信息库和知识管理平台。 课题2是基础实验研究，从干细胞和NEI网络功能的角度探索和深化对“肾藏精”脏象理论的认识。 课题36在“肾藏精”脏象理论指导下，以“肾主生殖”、“肾主骨”、“肾生髓”、“脑为髓之海”等理论为线索，选择“肾精亏虚、命门火衰”型典型疾病（不孕不育、骨质疏松症、老年性痴呆、障碍性贫血），从病（证）探因，观察“肾精亏虚、命门火衰”证候与干细胞和NEI