第11章荧光分析法.ppt

2008年诺贝尔化学奖 绿色荧光蛋白 GFP greenfluorescenceprotein 科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质 GFP标记的微管 荧光与荧光分析法 fluoresceneandfluorometry 荧光 fluorescene 物质分子接受光子能量被激发后 从激发态的最低能级返回基态时发射出的光 荧光分析法 fluorometry 根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法 选择性好 灵敏度高 检测限达10 10g ml 甚至10 12g ml 电子能级的多重态 电子能级的多重度 M 2S 1S为电子自旋量子数的代数和 0或1 M 1 单重态 用S表示 singlestate M 3 三重态 用T表示 tripletstate 能量 单重基态 激发单重态 激发三重态 禁阻跃迁 S2 S1 S0 T1 吸收 发射荧光 发射磷光 能量 l2 l1 l3 外转换 l 2 体系间跨越 振动弛豫 内转换 激发态 基态的能量传递途径 传递途径 辐射跃迁 荧光 内转换 外转换 体系间跨越 振动弛豫 无辐射跃迁 激发态停留时间短 返回速度快的途径 发生的几率大 发光强度相对大 荧光 10 7 10 9s 第一激发单重态的最低振动能级 基态磷光 10 4 10s 第一激发三重态的最低振动能级 基态 磷光 激发光谱与荧光光谱excitationspectrumandfluorescencespectrum 1 荧光 磷光 的激发光谱 固定测量波长 化合物发射的荧光 磷光 强度与照射光波长的关系曲线 2 荧光 磷光 的发射光谱 固定激发光波长 化合物发射的荧光 或磷光强度 与发射光波长关系曲线 nm F 200 260 320 380 440 500 560 620 荧光激发光谱 荧光发射光谱 磷光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧 磷 光光谱 GFP的激发光谱与荧光光谱 激发光谱与发射光谱的关系 1 Stokes位移荧光发射波长大于激发波长的现象 内转换和振动弛豫是主要原因 2 发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级 吸收不同波长的能量 产生不同吸收带 但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态 产生一个发射带 3 镜像关系通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称关系 nm 蒽的激发光谱 虚线 和荧光光谱 实线 S0 S1 V 0 V 1 V 2 V 0 V 1 V 2 b0 b1 b2 c2 c1 c0 E2 E1 E2 E1 b0 c0 b1 b2 c1 c2 镜像关系解释示意 荧光的产生与分子结构的关系 分子产生荧光必须具备的条件1 具有强的可见紫外吸收 长共轭分子 2 具有一定的荧光效率 f 刚性平面分子 长共轭结构 苯萘蒽 ex205nm286nm356nm em278nm321nm404nm f0 110 290 36 维生素A ex 327nm em 510nm 刚性平面结构 可降低化学键的旋转 增加共轭健的共平面性 使荧光效率增加 如荧光素和酚酞有相似结构 荧光素有很强的荧光 酚酞却没有 取代基 第一类 增加分子的 电子共轭程度 使荧光效率提高 荧光波长增长 如 NH2 OH OCH3 NHR CN 第二类 减弱分子的 电子共轭程度 使荧光减弱甚至熄灭 如 COOH NO2 C O X NO SH 第三类 对 电子共轭作用较小 对荧光的影响不明显 如 R SO3H NH3 荧光试剂 能与弱荧光物质或无机离子反应生成强荧光物质的试剂 可扩大荧光分析法的应用范围 荧光胺 测定脂肪伯胺和芳香伯胺 邻苯二甲醛 OPA 测定伯胺 氨基酸 丹酰氯 测定含有伯 仲胺基及酚基的生物碱测定无机离子的荧光试剂 影响荧光强度的外部因素 1 温度荧光强度对温度变化敏感 温度增加 荧光效率降低 2 溶剂溶剂的极性 氢键 配位键的形成 粘度都将使化合物的荧光发生变化 极性 粘度增强 荧光波长长移 强度增加 3 酸度对酸碱化合物 溶液pH的影响较大 需要严格控制 不同荧光物质有其最适宜的pH值范围 影响荧光强度的外部因素 4 荧光熄灭剂 重金属离子 卤素离子 氧分子 硝基化合物 重氮化合物 羰基和羧基化合物 5 散射光 注意溶剂的拉曼散射的影响 瑞利光 Reyleighscatteringlight 拉曼光 Ramanscatteringlight 波长比入射光更长的拉曼光 对荧光测定的干扰更大 a b a 硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光b 0 1mol L硫酸溶液在不同波长下的拉曼散射光 溶液的荧光测定 荧光F 定量依据 荧光强度F正比于吸收的光强度Ia和荧光量子效率 F K Ia由朗伯 比耳定律 Ia I0 1 10 cl F K I0 1 10 cl K I0 1 e 2 3 cl 浓度很低时 将括号项近似处理后 F 2 3K I0 cl Kc注意 当 cl 0 05时 F与C不成正比 定量分析方法 校正曲线法配制标准溶液系列 分别测定系列中各溶液的荧光强度F 作校正曲线F C图 根据待测溶液的Fx值 在图中求出待测液的Cx 若空白溶液的荧光强度不能校正到0 则须作 F F0 C图 定量分析方法 比例法 联立方程法 荧光计 光源 第一单色器或滤光片 样品池 检测器 第二单色器或滤光片 记录仪 激发 荧光 滤光片荧光计滤光片 单色器荧光计荧光分光光度计 氙灯高压汞灯染料激光器 光电倍增管 荧光法应用 1 无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量 可测量约60多种元素 铍 铝 硼 镓 硒 镁 稀土常采用荧光分析法 氟 硫 铁 银 钴 镍采用荧光熄灭法测定 铜 铍 铁 钴 锇及过氧化氢采用催化荧光法测定 铬 铌 铀 碲采用低温荧光法测定 铈 铕 锑 钒 铀采用固体荧光法测定 荧光法应用 2 有机化合物的荧光分析荧光分析法主要应用于有机物 生化物质 药物的测定 200多种 包括 有机化合物如 多环胺