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液相色谱柱的应用 1 1 色谱柱填料 色谱柱的填料有 Al2O3 聚合物基质 硅胶基质 一 Al2O3基质 优点 PH稳定性好1 14缺点 化学修饰难 2 1 色谱柱填料 二 聚合物基质 优点 1 PH稳定性好1 132 可进行表面化学处理以满足反相色谱 离子交换色谱 疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求 3 在中等pH条件下对强碱性物质具有更好的峰形 缺点 1 孔径结构复杂 孔径不均匀 导致柱效不够高2 有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨或受损 3 优点 1 目前应用最广泛的基质材料2 具有高机械强度和高的比表面积3 在中等pH条件下对强碱性物质具有更好的峰形 4 高效 重现性好5 可利用直接的广泛的表面健合反应来满足正相 反相 离子交换 疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求 三 硅胶基质 缺点 1 硅胶基质的PH范围是3 8 在高或低的pH下都容易溶解 2 具有容易导致强碱性物质拖尾的表面活性和带酸性的硅羟基 1 色谱柱填料 4 2 1 硅胶纯度定义 填料硅胶的纯度与残留金属的离子浓度 硅胶纯度对强极性化合的分离最重要 A型硅胶 纯度较低 金属硅酸盐制备而来 具有很高的金属含量 可用作中性化合物和非离子化合物的分离 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高 硅羟基的PKa低 导致碱性化合物发生拖尾 2 色谱柱物理性能 5 2 色谱柱物理性能 B型硅胶 纯度高 酸性较弱的硅胶 这种硅胶是以无金属的工艺制备而来 只含有微量的金属可用于分离离子化合物和可电离的化合物 特别是碱性化和物 6 2 2 色谱柱的尺寸柱的长度和内径短柱 15 100mm 运行时间短 柱压低长柱 150 250mm 分辨率高 运行时间长窄径柱 2 1mm 检测器灵敏度高宽径柱 3 21 2mm 载样量高 2 3 颗粒形状 球型或无定型 当使用黏度较大的流动相时 球型颗粒可降低柱压 延长色谱柱寿命 1 球形填料装柱后平均孔径分布比较窄 柱床结构均匀 柱效高 重现性好 2 无定形填料平均孔径分布较宽 柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩宽 2 色谱柱物理性能 7 2 4 粒径 粒径是指柱填料的颗粒直径的大小 实际上色谱柱上所标的粒径是一个平均值通常3 10 m 平均粒径越小 颗粒分布度越小 色谱柱效越高 反压亦越高 2 色谱柱物理性能 8 2 5 表面积 定义 颗粒外表面与内部孔面积的总和 以m2 g表示 高表面积对于多组分样品的分离具有较强的保留能力 柱容量和分离度 表面积低的填料通常能迅速达到平衡 对于梯度洗脱尤为重要 2 色谱柱物理性能 9 2 6 孔径 定义 是指填料颗粒的孔或腔的平均尺寸 范围80 300 大孔的填料颗粒 可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间 达到充分分离 改善峰形 较小的孔径提供较高的表面积 可用于较大的载荷量 并保留小的有机化合物 这种填充柱可用于小分子有机物到聚合物的分离 样品MW4000 选择300 的孔径 2 色谱柱物理性能 10 3 色谱柱化学性能 3 1键合类型 单键键合 键合相分子与基体单键相连 单齿键合提高传质 加快色谱柱平衡 聚合体键合 键合相分子与基体多点相连 双齿键合 增加色谱柱稳定性 增加色谱柱的载样量 填料稳定性好了 组分的保留时间重现性就好 11 3 2碳含量 高碳覆盖率 提高分辨率 分析时间长 低碳覆盖率 缩短运行时间 可以通过增加碳键的长度或增加键合密度来增加碳含量 含碳量增高了 利于不易保留化合物的分离 定义 碳含量即填料中的含碳量 传统的测量技术是将填料加热到碳氢键断裂 然后通过测定损失的重量或形成的二氧化碳来计算碳含量 但是不能单独以碳含量来预测色谱行为 它还与硅胶的密度 键合相的密度填料的表面积等等有关系 3 色谱柱化学性能 12 3 3封端 减轻待测组分与硅胶表面残留的酸性羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象 对于极性样品 未封端与经过封端处理的色谱柱在选择上有明显差异 适用范围 低PH 1 8 值下 分析酸性 中性组分碱性化合物易产生二次保留 引起拖尾 3 色谱柱化学性能 13 适用范围 中等PH 2 9 值下 分析酸性 碱性和中性组分 尤其碱性组分峰形优异 柱寿命长 端基封尾可改善对极性化合物的吸附或拖尾 3 色谱柱化学性能 14 柱规格的选择直接影响分析速度 分离能力 检测能力及每次分析的溶剂消耗等 柱规格包括两方面 柱长和柱内径 对相同的分析时间和分离度来说 内径大的柱子比内径小的柱子多消耗溶剂 较小内径的柱子对相同的检测信号来说所需样品量亦较少 因此 在样品量有限时 可使用小内径柱 柱长度增加虽可改善分离效果 但阻力也随之增加 必须提高入口压力 长柱可以给出高分离度 短柱可提供快速分离 我们可以根据样品情况去选用合适的色谱柱 3 色谱柱化学性能 15 用窄的内径 小的粒径会引起高柱压 柱压是同时影响增加分离度和减少分析时间的主要障碍 分离度 分析时间及柱压三者相互制约 选择好其中两者 则第3个因素也就选好了 常见规格色谱柱 3 色谱柱化学性能 16 4 常见色谱柱介绍 YMC packODS A150 4 6mmS 5um 品牌 C18RP18 亲水性AQ 柱长 柱内径 粒径 球型 4 1色谱柱上的信息 17 4 2C18 C8和C4柱 定义 在硅胶上键合C18 C8和C4的烷基碳链 不同点 碳载量不同 C18的载碳量几乎是C8的一倍 C4的载碳量最低 相同点 分离机理相同 适用点 C18对非极性化合物保留能力强 C8 C4的碳链较短 对非极性化合物的保留要比C18弱 所以对强保留的化合物可用C8 C4代替 另外由于链长短的关系 C18与C8 C4在分离不同分子大小的物质时会有选择上的差异 4 常见色谱柱介绍 18 C18柱 定义 C18 简称 ODS 柱 即十八烷基键合硅胶填料 这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用 它可完成高效液相色谱70 80 的分析任务 由于C18是长链烷基键合相有较高的碳含量和更好的疏水性 对各种类型的生物大分子有更强的适应能力 应用最为广泛 4 常见色谱柱介绍 19 1 选用经过烷基化处理封口的填料可防止碱性化合物的拖尾现象 2 选用含碳量高的柱子 增加保留值 3 选用较短的柱子 如15cm 7 5cm 提高分离效率 4 选用小颗粒度的填料 提高分离度 5 对分子量大的组分选用大孔径填料的柱子 C18柱选用的基本原则 4 常见色谱柱介绍 20 C8 C4柱 C8 C4等短链烷基键合相适合做极性小以减弱保留 缩短分析时间 另一方面又可以分析氨基酸 小肽等生物分子 4 常见色谱柱介绍 21 4 3苯基柱 柱上键和固定相有苯基 也属于反相柱 不过由于苯基有不同的物理特性 例如空间位阻 具有 电子 所以对某些化合物有较好的分离 与C18 C8和C4相比 苯基与带芳香环化合物形成p p共轭相互作用 增强此类化合物的相对保留 这种优良的选择性与对非极性化合物保留能力较弱的特点相结合 使得 Phenyl相成为分离 分析同时含极性和非极性复杂混合物的最佳选择 4 常见色谱柱介绍 22 苯基柱的特点 1 苯基具有独特的空间位阻特性 对某些化合物有较好的分离 2 与C18 C8相比 有 电子的苯基能增加带芳香环的化合物的保留3 与C18 C8相比 苯基柱对一般非芳香族的化合物保留要弱4 苯基柱是分离 分析同时含极性和非极性复杂混合物的最佳选择 苯基柱的适用范围 1 用于分析芳香族化合物 对这类化合物有独特的分离性 2 可以分析小分子的肽类和蛋白 4 常见色谱柱介绍 23 4 4氰基柱 氰基柱 既可用于正相色谱 又可用于反相色谱 其在用于正相色谱时 可使用如正己烷的低极性流动相 在用于反相色谱时 可使用甲醇或水的强极性流动相 CN的亲脂性在反相色谱固定相中相对较低 并且由于具有 电子作用腈基 其与ODS相比显示出不同的选择性 适用于在ODS上分离时间太长的组分的分离 以及在ODS上最优化色谱非常困难的场合 4 常见色谱柱介绍 24 氰基柱的特点 1 氰基属于中等极性基团 正相 反相都能应用 但选用不同分离模式时 洗脱的次序会不同 2 氰基柱可代替硅胶柱 氰基柱比硅胶柱更易快速平衡 表面活性比非衍生硅胶更一致 具有更好的重现性 3 独特的 电子作用氰基 可以同时使样品中含有亲水性及疏水性化合物的化合物有很好的分离 4 在ODS柱中需要做梯度洗脱的 用氰基柱大部分不再需要 4 常见色谱柱介绍 25 氰基柱的适用范围 1 做为反相色谱柱 极性最强 所以当分析在C18上保留太强峰很难看的样品时 可用氰基柱 2 CN的柱子适合用于C18柱子出峰早 极性大 3 独特的 电子作用氰基 可以同时使样品中含有亲水性及疏水性化合物的化合物有很好的分离 4 常见色谱柱介绍 26 使用氰基柱注意事项 1 同一根氰基柱最好在同一种体系中使用 交替调换正相 反相会迅速缩短色谱柱的使用寿命 2 在不得已情况下要正相 反相调换时 需要用异丙醇过渡 4 常见色谱柱介绍 27 4 4氨基柱 1 氨基柱是一种不太稳定的柱子 并不是常用柱 这是因为键合的氨丙基很容易水解 2 正相 反相都可以使用 氰基柱的特点 4 常见色谱柱介绍 28 氨基柱的适用范围 1 在反相系统中 氨基柱的保留较弱 一般用于烃类 石油馏分的分离 分析 2 在正相系统中 通常在氰基柱无法分离重叠峰时才考虑使用氨基柱 使用氨基柱注意事项 1 作为反相柱时 要注意流动相的pH范围 pH越低越容易水解 流行相中水的比例越高 也越容易发生水解 2 长期不用时 要清洗后保存在纯的有机相中 分析完酸性物质后 氨基有可能被质子化 导致柱效下降 可以用含0 5 NH3 H2O50 50的乙腈 水冲洗该柱 冲洗后再用不含有碱的流动相洗去多余的氨 4 常见色谱柱介绍 29 AgilentStableBond 1 PH范围 1 82 使用了空间位阻大的硅烷3 未封端 优点 可以在低PH下分析酸性 碱性和中性组分 峰形优异 5 不同品牌色谱柱介绍 侧链基团 二异丁基或二异丙基提供空间位阻可避免硅胶在低PH下水解 破坏 Agilent 30 AgilentEclipseXDB 1 致密键合了二甲基烷基硅烷2 双封端3 PH范围 2 9 优点 可以在中等PH下分析酸性 碱性和中性组分 峰形优异 柱寿命长 5 不同品牌色谱柱介绍 31 AgilentBonus RP 1 嵌入极性基团2 使用空间位阻大的硅烷3 三封端4 PH范围 2 9 优点 可以在中等PH下分析酸性 碱性和中性组分 可用于100 全水相 峰形优异 柱寿命长 5 不同品牌色谱柱介绍 32 AgilentExtend C18 1 采用独特的双齿键合结构2 双封端3 pH范围 2 11 5 优点 可以在中高PH下分析酸性 碱性和中性组分 尤其碱性组峰形优异 柱寿命长 5 不同品牌色谱柱介绍 33 Waters 1 XTerra XTerra是一种超越极限的色谱柱 其填料是利用先进的无机 有机杂化颗粒技术由两种高纯单体合成的高纯硅胶填料 传统硅胶填料有大量裸露的OH 1 大量的 CH3有机硅烷单元2 OH硅羟基数量大大减少3 骨架分布均匀 Surface core Surface core 传统硅胶填料 XTerra杂化颗粒 5 不同品牌色谱柱介绍 34 1 极宽的pH范围 1 12 2 高温稳定性3 极佳的对称峰形 含有甲基硅烷单元 4 极快的分离速度和极佳的分离度5 具有不同的键合相 和多种规格满足各种不同的需求 XTerra柱的优点 5 不同品牌色谱柱介绍 35 XTerraMS 1 采用独特的三点键合结构2 适合与MS检测器配合使用3 封端4 PH范围 1 12 5 不同品牌色谱柱介绍 36 XTerraRP 1 嵌入极性基团2 适合与紫外 荧光 电化学以及示差折光等多种检测器配合使用3 有封端4 pH范围 2 12 5 不同品牌色谱柱介绍 37 2 XBridge XBridge是XTerra的第二代杂化颗粒专利技术 XBridge骨架上具有不易水解的乙基桥存在 表现出对高pH溶液极好的耐受性 加上颗粒本身就具有极好的机械强度 使XBridge色谱柱在高pH值流动相中具有极佳的寿命 3OH Si OH 4 传统硅胶填料 5 不同品牌色谱柱介绍 38 XBridge杂化颗粒 5OH HO 3Si CH2 CH2 Si OH 3 XBridge具有抗高pH进攻的能力 另外整个骨架均匀分布 有效交联的乙基桥式杂化颗粒表现出前所未有的机械强度和水解稳定性 5 不同品牌色谱柱介绍 39 XBridge柱的优点 1 极宽的pH范围 1 12 2 低pH条件下高温 800C 仍具稳定性3 高pH值的耐受性大大提高4 色谱柱寿命长以及对缓冲液体系表现出很大稳定性5 具有不同的键合相 和多种规格满足各种不同的需求 5 不同品牌色谱柱介绍 40 6 色谱柱的使用 为延长色谱柱使用寿命应注意以下几点 6 1样品的前处理 最好使用流动相来溶解样品 2 使用预柱除去样品中强极性或与填料产生不可逆吸附的杂质 3 样品要用0 45 m的过滤膜过滤 41 6 2流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的 因此要求流动相具备以下的特点 流动相对样品具有一定的溶解能力 保证样品组分不会沉淀在柱中 或长时间保留在柱中 流动相与样品不产生化学反应流动相的黏度要尽量小 以便得到好的分离效果 降低柱压降 延长泵的使用寿命 可运用提高温度的方法降低流动相的黏度 4 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应 如使用UV检测器 最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制 在流动相配制好后 一定要进行脱气 除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测 还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用 6 色谱柱的使用 42 6 3流动相流速的选择 因柱效是柱中流动相线性流速的函数 使用不同的流速可得到不同的柱效 对于一根特定的色谱柱 要追求最佳柱效 最好使用最佳流速 对内径为4 6mm的色谱柱 流速一般选择1ml min 对于内径为4 0mm柱 流速0 8ml min为佳 含水流动相最好在实验前配制 尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜 最好加入叠氮化钠 防止细菌生长 2 流动相要求使用0 45 m滤膜过滤 除去微粒杂质 使用HPLC级溶剂配制流动相 使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命 提高柱性能 6 4注意 6 色谱柱的使用 43 反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈 水中的 新柱应先使用10 20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱 6 5 色谱柱的平衡 平衡开始时将流速缓慢地提高 用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线 缓冲盐或离子对试剂流速如果较低 则需要较长的时间来平衡 如果使用的流动相中含有缓冲盐 应注意用纯水 过渡 即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡 分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子 6 色谱柱的使用 44 7 1色谱柱的再生 7 色谱柱的维护 长期使用的色谱柱 往往柱效会下降 柱子的理论塔板数减低 可以对色谱柱进行再生 再生方法 极性固定相 如Si NH2 DIOL基色谱填料 的再生 正庚烷 氯仿 乙酸乙酯 丙酮 乙醇 水 至少20倍柱体积 非极性固定相 如反相色谱填料RP 18 RP 8 CN等 的再生 水 乙腈 氯仿 或异丙醇 乙腈 水 45 注意事项 在对NH2改性的色谱柱进行再生时 由于NH2可能以铵根离子的形式存在 因此应该在水洗后用0 1M的氨水冲洗 然后再用水冲洗至碱溶液完全流出 0 05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱 如果简单的用有机溶剂 水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质 在水洗后加用0 05M稀硫酸冲洗非常有效 7 色谱柱的维护 46 7 2 色谱柱的维护 1 使用预柱保护分析柱 硅胶在极性流动相 离子性流动相中有一定的溶解度 2 流动相的PH应在使用的范围内3 如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相 应在实验完毕柱子冲洗干净 并保存于甲醇或乙腈中4 氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性 故使用时要注意 柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂 以避免腐蚀 7 色谱柱的维护 47 在色谱分析过程中常常需要使用缓冲盐来调节流动相的pH值 缓冲盐的不当使用对色谱柱可能造成柱压升高 柱效下降以及使化合物的保留时间发生变化等影响 正确使用缓冲盐 1 柱压升高 原因 缓冲盐使用不当导致缓冲盐析出 堵塞塞板和键合相颗粒之间的孔隙 阻碍流动相传质 引起柱压升高 2 相同化合物的保留时间发生变化 原因 如果没有冲洗干净就进行进样 色谱柱内含有的盐会使化合物的保留时间发生变化 7 色谱柱的维护 48 6 色谱柱的维护 3 柱效下降 原因 1 有些缓冲盐会渗入到键合相的深处 损害硅胶基体 导致色谱柱键合相流失 柱床变松 柱效下降 2 凝结在键合相表面 使C18碳链难以舒展 对物质的保留能力下降 导致柱效下降 因此用过缓冲盐后需要对色谱柱进行冲洗 水中缓冲盐浓度较大时应特别引起注意 49 6 色谱柱的维护 缓冲盐析出的补救方法 1 方案1 用甲醇 水 20 80以1 0ml min流速35摄氏度条件下反向冲洗色谱柱120min2 方案2 用甲醇 水 20 80以0 2ml min流速反向冲洗色谱柱过夜 1 等度条件 使用缓冲盐前和使用后需用过渡流动相以1 0ml min流速冲洗60min 使用后去除缓冲盐的另一个方法是用过渡流动相以0 2ml min流速冲洗色谱柱过夜 2 梯度条件 用含有缓冲盐的流动相跑梯度之前 用与初始流动相组成相同的过渡流动相以1 0ml min流速冲洗60min 再用该过渡流动相以1 0ml min冲洗色谱柱120min 含缓冲盐流动相的梯度设定应尽量平缓 以避免梯度过程中缓冲盐析出 注意 过渡流动相是指有机相和水相的组成与分析流动相相同 区别只是过渡流动相不含缓冲盐 50 7 HPLC故障及排除方法 7 1 保留时间变化 51 7 2 保留时间缩短 7 HPLC故障及排除方法 52 7 3 保留时间延长 7 HPLC故障及排除方法 53 7 4 出现肩峰或分叉 7 HPLC故障及排除方法 54 7 5 出现鬼峰 7 HPLC故障及排除方法 55 7 6 基线噪音 7 HPLC故障及排除方法 56 7 7 峰拖尾 7 HPLC故障及排除方法 57 7 8 峰展宽 7 HPLC故障及排除方法 58 特殊HPLC方法开发 59 1 分析模式的选择 1 1 正相色谱 属于吸附色谱 固定相极性 流动相极性 固定相 极性流动相 己烷 庚烷 非极性 非极性物质先出峰正相柱 多以硅胶为柱填料 根据外型可定为无定型和球型两种 另一类正相填料是硅胶表面键合 CN NH2等官能团即所谓的键合相硅胶 1 2 反相色谱 属于分配色谱 固定相极性 流动相极性 固定相 非极性流动相 甲醇 乙腈 极性 极性物质先出峰 60 样品 溶于有机溶剂 溶于水 溶于四氢呋喃 非离子化 离子化 溶于水 溶于正己烷 溶于甲醇或甲醇 水或乙腈或乙腈 水 用硅胶的正相模式 用键合相的正相模式 用键合相的反相模式 用键合相的反相模式 低分子凝胶渗透色谱 用键合相的反相模式 抑制电离反相键合相色谱 离子对键合相的反相模式 用硅胶的正相模式 离子交换模式 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱 大孔填料的离子交换模式 用大孔填料的反相模式 分子量 2 000 分子量 2 000 溶于有机溶剂 1 分析模式的选择 样品 分子量 2 000 61 流动相调整的三原则 2 分析方法开发 1 由强到弱 一般先用90 的乙腈 或甲醇 水 或缓冲溶液 进行试验 这样可以很快地得到分离结果 然后根据出峰情况调整有机溶剂 乙腈或甲醇 的比例 2 三倍规则 每减少10 的有机溶剂 甲醇或乙腈 的量 保留因子约增加3倍 此为三倍规则 这是一个聪明而又省力的办法 调整的过程中 注意观察各个峰的分离情况 3 粗调转微调 当分离达到一定程度 应将有机溶剂10 的改变量调整