羊痘病毒的研究进展.docx

羊痘病毒的研究进展施程洪，兰虎云，朱明旺，董学远，王继华*( 中牧实业股份有限公司保山生物药厂，云南保山 678000)收稿日期2014 07 03 文献标识码A 文章编号1002 1280 ( 2014) 09 0061 05 中图分类号S852 654摘 要 从羊痘的流行特点、羊痘病毒基因组结构特征、热点蛋白研究、羊痘的诊断和检测、疫苗研究五个方面进行了较为详细的综述，以期为羊痘病毒的研究及预防控制羊痘提供参考。关键词 羊痘; 流行特点; 基因组结构; 蛋白; 诊断; 疫苗esearch Progress of Goat Pox VirusSHI Cheng hong，LAN Hu yun，ZHU Ming wang，DONG Xue yuan，WANG Ji hua*( Baoshan Bio pharmaceutical Factory of the China Animal Husbandry Industry Co Ltd，Baoshan，Yunnan 678000，China)Abstract: The disease seriously affects the development of sheep industry and international trade，brings hugeeconomic losses to the development of animal husbandry economy This paper mainly reviewed in detail on the five aspects of goat pox virus epidemic characteristics，genome structure，hot protein research，diagnosis，vaccine research，provided an important theoretical basis for the study and prevention of goat pox disease controlKey words: pox; epidemic characteristics; genome structure; protein; diagnosis; vaccine羊 痘 病 毒 ( Capripoxvirus，CPV ) 引 起 发 热、鼻炎、结膜炎、过度流涎、皮肤黏膜发生丘疹和疱疹病 变1，主要感染山羊、绵羊和牛，另外人也可感染此国、瑞典、印度依据流行病学和临床症状都有人类感染羊痘病毒的报道3。因此，做好预防和控制羊 痘的发生，具有重要的经济意义和社会意义。病毒。羊 痘病毒可引起山羊痘 ( Variolacaprina;羊痘流行现状羊痘最早记载可见于公元前 200 年，目前在世 界范围内还在持续进行流行传播。主要分布 于 非洲北部和中部、中东地区和亚洲的部分国家，流行 较为严重。与我国接壤的周边国 家，巴 基 斯 坦、俄 罗斯、蒙古等国家均有本病的流行4。近几年我国 的山东、内蒙古、黑龙江、甘肃、宁夏、青海等都有羊 痘发生的相关报道3 4。该病呈地方流行特点3， 以山羊、绵羊为主要感染对象，年轻动物感染死亡率可达 50% ，感染羔羊死亡率可达 100%1，在 自 然感染情况下，山羊发病的严重性相比较于绵羊要1Goat pox;pox; SPV )GPV ) 、绵 羊 痘 ( Variolacaprina; Sheep和 牛 的结节性疹块病 ( Lumpyskindisease，LSD) ，它们之间在血清上呈交叉反应，自然条件下不会发生交叉感染，同属痘病毒科( poxiridae) ，脊 椎动物痘病毒亚 科 ( chordopoxvirade) ，羊 痘 病 毒 属 ( Capripoxvirus) 2。2002 年被世界卫生组织( OIE) 列为须申报类动物疾病，我国将其列为一类动物疾病3。该病的危害性很大，可严重影响畜牧业生产 和动物及其产品的国际贸易，给国民经济造成巨大的经济损失。此外，其对公共卫生也 有 所 影 响，中作者简介: 施程洪，硕士，兽医师，从事动物疫苗的生产、研究及开发工作。通讯作者: 王继华。E mail: bsymcwjh sina com62中国兽药杂志2014，48( 9) : 61 65 / 施程洪，等轻5，爆发的严重性取决于易感羊群的大小、流行毒株的毒力以及羊群的品种和年龄。2基因组特征羊痘病毒的基因组全长约为 150 kb，共有 147 个开放阅读框( OF) ，编码密度为 93% ，所编码的 蛋白质为 53 2027 个氨基酸不等。中间区域为保 守序列，主要承担病毒的复制及组装功能，两端基 因序列( OFs001 023 和 OFs124 156 ) 参 与 胞 质分裂丝蛋白、白细胞介素 10 ( IL 10 ) 、表皮生 长因子样蛋白( EGF like protein) 、PK 阻遏蛋白、致病基因、选择宿主范围基因的编码工作，不同地 方分离的羊痘病毒株之间在基因组长度上有一定 的差异。通过限制性核酸内切酶酶切以及核酸 杂 交对 SPPV 和 GTPV 进行分析发现，SPPV 和 GTPV 之间的核苷酸序列的同源性可以达到 96% 97% ， 通过对 SPPV 的 TU 株、SA 株、以及从 SPPV 疫苗中 分离得到的 NK 株、GTPV 的 PL 株和从 GTPV 疫苗 中分离得到的 GV 株的研究发现，在它们的末端反 向重复序列中都含有至少一个 2200 bp 左右的碱基 序列，病毒属成员之间在末端区串联重复序列的大小以及功能上有很大的区别。到现在为止，并没有 一种末端串联重复序列被发表，通过和已经发表的 限制性酶切片段进行比较分析 得 出，SPPV 的 所 有 分离株的基因组中都存在着小于 200 bp 的多余的 末端重复序列和发卡序列。血清学试验没有办法 区 分 CPV 各 毒 株 的 差 异，通过 CPV 基因组的酶切分析表明 SPPV 和 GT- PV 还是有差异的。如 SPPV TU 株与 SA 株的氨基 酸序列只有 193 处存在差异，与 NK 株有 188 处差 异; GTPV PL 株与 GV 株序列 只 有 7 处 存 在 差 异， 这些差 异 对基因的功能是没有影响的。 SPPV 和GTPV 的基因组序列平均 96% 氨基酸序列相同。 P32，GPC 和 PO30 基因在羊痘病毒之中是高度 保守的。它们的序列信息可用于区分 SPPV，GTPV和 LSDV，呈现不同的病毒株之间的遗传关系6 9。构建表达，获取特异性强的重组 P32 蛋白，用其进行诊断技术、研究亚单位疫苗，对于实施 CPV 的预防具 有重要意义。但是，由于 P32 蛋白的跨膜区对细胞具 有毒性作用，造成了表达量低、难纯化重组 P32 蛋白。 因此，如何提高 P32 蛋白的表达量、获取纯度更高的重 组 P32 蛋白是解决 P32 蛋白应用研究的关键技术环 节。一方面可以通过对 P32 蛋白的跨膜区进行基因修 饰，降低 P32 蛋白在表达中对细胞的毒性作用，增加细 胞内的表达量; 二是筛选和构建更适宜获取 P32 蛋白 表达产物的表达系统。3 2白介素 18 结合蛋白( IL 18BP)近年来通过对白细胞介素 18 受体( IL 18) 及其转导机制进行的相关研究发现: IL 18、辅助蛋白( Ac- PL) 、IL 18BP 三种与 IL 18 有关的蛋白质都可 以在体外消除 IL 18 诱导的 IFN 和 IL 18 的生成及对 NFB 的激活。表明 IL 18BP 具有拮抗生物学活性的作 用，是 IL 18 的 拮 抗IL 18剂11。同样身为痘病毒的羊痘病毒推测应该也含有 编码 IL 18BP 的基因，同样具有抑制 IL 18 诱导 产生 IFN 的活性能 力。刘 文 强 等 对 Tulman 等 完成的羊痘病毒基因组序列( Genebank: 21426071 ) 中编 码 的 IL 18BP 的基因进行了克隆和 原 核 表 达，研究了该重组蛋白抑制 IL 18 诱生 IFN 的 生物学活性。结果表明该重组蛋白具有明显 抑 制 山羊 IL 18 诱导 PBMC 分泌 IFN 的生物学活 性，是 IL 18 的一种良好的体外拮抗剂。IL 18 的过度表达与机体的自身免疫性疾病以及其他炎性疾病的发生发展有着极其密切的关系，如促进某 些类型的关节炎的发生和肺炎肉芽肿的增生11。TK 基因 TK 基因位于 CPV 病毒基因组的中3 3部 OF66 内，距离两端的 IT 序列分别为 52 kb 和91 kb，编码 174 个氨基酸的多肽。分子杂交试验证 明各种痘病 毒 TK 基因之间的同源性以及痘病毒 TK 基因与疱疹病毒 TK 基 因 之 间 的 同 源 性 很 低。 在痘病毒科中，不同病毒属的 TK 基因的位置存在差异12，但他们的共性是均位于基 因 组 的 中 间 区 域而且具有较高的保守性。TK 基因是当今痘病毒研究中应用范围非常广泛的一个非必需区，应用此非必需区插入外原基因构建重组病毒的报道已有相关蛋白研究P32 蛋白 CPV P32 蛋白分子量为 32 ku10，33 1是 CPV 毒株共有且特异性强的结构蛋白。 由 于P32 蛋白包含 1 个重要的抗原决定簇位点，可以诱 导产生良好的中和抗体。通过克隆和表达系统 的632014，48( 9) : 61 65 / 施程洪，等中国兽药杂志不少，Bhan uprakash V 等13利用 TK 基因作为非必需区构建了重组 CPV 。郭巍等克隆了我国山羊痘1995 年 Carn 建立了基于 P32 蛋白检测羊痘抗原的 ELISA 方法。Heine 和 Stevens 等在 1999 年以P32 蛋白建立了检 测 羊 痘 抗 体 的 ELISA 方 法。1997 年 ao 等建立了免疫捕获 ELISA，该方法以兔 抗绵羊痘病毒的高免血清作为捕获抗体，同时检测 绵羊痘和 山 羊 痘 痂 皮中痘病毒抗原。ao 等 认 为 捕获 ELISA 可以作为绵羊痘和山羊痘共同的检测 方法，但该方法单独使用时有一定的限制，需要与对流免疫电泳试验共同应用才能确诊16。1998 年 Sedhukhan 等成功应用了 DOT ELISA 进行山羊痘 抗体的检测17。ELISA 作为一种快速检测方法，在 快速鉴别诊断方面发挥了积极的作用，但也存有不足的地方，P32 蛋白的特异性及纯化质量在很大程度上对于 ELISA 方法检测的特异性和准确性有较 大影响。建立 P32 蛋白特异性及纯化质量评价 标 准，对评价 ELISA 检测方法具有十分重要的意义。弱毒疫苗 ( G T PV TY)的 TK 基 因，并利用同源重组构建了带有同源重组臂和筛选标记的转移载体。不过，目前研究者对 GTPV 进行的相关缺失 疫苗及活载体的研究还处于初始研究阶段，还没有 实质性的突破。一方面是构建和筛选稳定性好 的 通用转移载体存在困难; 另一方面是构建好的缺失 疫苗其安全性、生物活性评价方法有待完善。IT 基因目前，部分研究者正在开展以检 3 4测 IT 基因片段为目标物的特异性 PC 检测方法的研究工作。M angina V O、徐长春和王开工均以 CPV 的 IT 基因片段为基础，开展了 IT 基因片段 的 PC 扩增及特性研究工作，研究表明: 以 IT 基 因片段为目标物的特异性 PC 检测方法特异性 强，可以简单、快速、特异的进行 SPPV、GTPV、疱疹 病毒( Herpesviruses ) 三者之间的鉴别诊断。与此 同时，罗阿东等14根据 CPV 的 IT 的核苷酸序列 设计引 物，以 CPV DNA 为 模 板，建 立 并 优 化 了 SYBGreen I 模式荧光 PC 检测 GPV 的 IT 基因 的方法。他们的研究结果均表明，IT 基因片段在 羊痘病 毒 属 保 守 序 列，可 以 针 对 IT 基 因 建 立 CPV 的 PC 检测方法。4 羊痘的诊断和检测4 3Western blot 试验 该方法是以羊痘病毒感染的细胞溶解物来检查血清样品中病毒结构蛋白的特异性抗体。相比于传统的实验室检测方法而言， 它克服了后者只能检测到抗体的总体水平而不能 检测到交叉抗体水平的缺点，大大提高了反应的灵 敏性和特异性。但该方法也有着自己的不足，试验 价格昂贵、操作难度大等限制了该方法大规模的 使用。4 1病毒的分离培养 羊痘病毒的分离培养有鸡4 4核 酸 检 测 方 法Markoulatos 等 建 立 了 多 重胚绒膜尿囊膜上增殖和易感细胞上增殖两种方法。接种 9 10 日龄的鸡胚绒膜尿囊膜一周后，可在绒 膜尿囊膜上出现典型的痘斑。在易感细胞如羊 睾 丸细胞等接种病毒后，产生细胞病变和胞浆内包含 体。感染细胞 单 层 常 在 5 d 内 全 部 死 亡。该 方 法 耗时、费力，且需要较高的专业知识和技能，不能在痘病爆发时快速得出诊断结果，所以在应用上也受 到限制。4 2 ELISA 试验 CPV P32 蛋白是目前世界上各 地分离、鉴定 的 所 有 CPV 毒 株 所共有的且特异性 很强的 CPV 结构蛋白。将羊痘病毒结构蛋白 P32 克隆表达、纯化后，将该表达的重组抗原用于生产 诊断试剂，包括 P32 的单价多克隆抗血清和单克隆抗体的生 产15，进而建立了高度特异性的 ELISA检测方法。PC 技术检测活组织中的羊痘病毒。该技术采用了 3 对引物，一 对 引 物 扩 增 微 管 蛋 白 基 因，在Genebank 中的登录号是 X01703。另外两对引物来 自于 KS 1 5 / KS 1 6 和 InS 1 1 / InS 1118，可 扩 增出羊痘病毒中的特异性基因片段。在和羊传染性口腔炎病毒进行鉴别诊断时，感染羊 传染性口腔炎病毒的活组织中只能扩增出 微 管蛋白，不能扩增出 KS 1 5 / KS 1 6 和 InS 11 / InS 1 1的产物。而感染羊痘病毒的活组织中 可以扩增出 KS 1 5 / KS 1 6 和 InS 1 1 / InS 1 1的产物。这比用单一引物 PC 方法有着更高 的敏感性和特异性，是一种简单、快速、准确且特异 性强的诊断方法，可在 24 h 内对样品作出检测，但 该方法偶尔也会出现一些假阴性的结果。实时定量 PC近几年，随着对羊痘病毒分4 564中国兽药杂志2014，48( 9) : 61 65 / 施程洪，等子水平认知的深入，对于羊痘病的检测技术在原有PC 检测手段上进行了改进，实时 定 量 PC 检 测 方法以更快速、更高的敏感性和特异性，并已在几个实验室开发进行应 用19 21。通过对眼分泌物、鼻拭子、直肠拭子样品应用 定 量 PC 检 测 方 法 进 行鉴别诊断，其检测敏感性和准确率均可达 90% 以上22。该方法可 以 检 测 的样品种类更宽泛，检 测 的敏感性和特异性更高，可以快速进行羊痘病的鉴 别诊断。4 6 间接荧光抗体试验 用丙酮将感染的细胞和对照组织培养细胞在 20 固定 10 min，4 保存。从苗的研究应该是切实可行的，但是在研究的过程中研究人员们也发现了 P32 蛋白在表达的过程中常 常会出现表达量低、表达不稳定等诸多问题，这就在 一定程度上制约着 P32 蛋白开发成亚单位疫苗的应 用前景23。因此，在羊痘病毒中寻找免疫原性更好、表达量更大、表达更稳定的基因是十分重要的。5 4活载体疫苗 病毒活载体疫苗的研究是当今疫苗研究中的一大热点。病毒活载体疫苗不 仅 具有长远的开发前景，生产成本低，便于免疫接种等 优点，而且类似于常规弱毒疫苗，能真实地再现外源基因编码蛋白的抗原性，并能全方位地激发免疫应答反应。在各种病毒活载体的研究中，痘病毒又 以其基因组大、含有多个复制非必需区、可以插入 大片段的外源基因等特点而引起了研究者的高度 重视。羊痘病毒基因组全长 150 kb，基因 组 较 大， 有表达多个外来基因的能力，既不影响其复制能 力，也不会影响抗原性，所以，以羊痘病毒基因组作为其他反刍动物病原基因的载体可以生产重组疫 苗，可以将牛瘟病毒、小反刍兽疫病毒的免疫原基 因插入羊 痘 病 毒 载 体，所研制的重组疫苗将对羊 痘、牛瘟、小反刍兽疫苗均有免疫作用24。5 开始稀释待检血清。以结合了异硫氰酸荧光素1的抗绵羊球蛋白作为指示剂，做间接荧光试验时，若用免疫绵羊或山羊的血清，有较深的背景颜色和非特异 性反应。免疫血清中存在培养细胞抗原的抗体，可引 起非特异性交叉反应，因此试验中应设未感染组织培 养物的阴性对照。此方法不能区分羊口疮、牛脓疱性口炎病毒及其他痘病毒。5 疫苗研究5 1弱毒疫苗 弱毒疫苗由于病毒粒子具有完备 的完整囊膜，接种动物后能有效刺激机体产生对带 有完整囊膜病毒粒子的免疫力，因此，具有良好免 疫保护作用。但是，在应用弱毒疫苗 的 过 程 中，弱 毒疫苗存在诱导羊痘发生，造成免疫失败的风险。 而疫苗的失效以及在非疫区使用活疫苗可能造成散毒等制约因素使得研究人员要进一步研究 CPV 疫苗。深入了解 CPV 毒性和宿主范围的基因基础 将会增加疫苗设计的有效性和多功能性。5 2 灭活疫苗 灭活疫苗安全性好、容易制备、可 以大规 模 生 产，而且能产生不错 的 免 疫 效 果。 但 是，灭活疫苗在进行细胞培养制备过程中几乎为裸 露的不完整囊膜病毒粒子，接种动物后不能激活机 体产生对带有完整囊膜病毒粒子的免疫力。它 们激活细胞免疫能力不强，只能提供短暂的免疫保 护，而羊痘病毒的免疫反应主要依靠细胞免疫，因 此常常导致免疫失败。6展 望羊痘作为一种古老的动物疾病，在其流行传播的过程中，研究人员对于其病源、流行特点、鉴别诊断、疫苗研究经历了从无知到逐渐认识和了解的过 程，取得了一些积极的研究成果。 对 于 羊 痘 的 研 究，今后应从以下几个方面为切入点开展工作: 一 是借助分子生物学发展技术，开展羊痘病毒基因组 的毒力基因、宿主基因、功能调控基因的深入研究， 为实施重组疫苗的研制提供新的途径; 二是特异性 检测诊断鉴别方法的建立，该方法不仅要求具有特 异性、快速性、准确性、广谱性的特 点，同 时 还 要 求 具有基层兽医人员容易掌握和实施的特点，便于在 基层开展实施，从源头上做好羊痘的诊断和 治 疗; 三是深入开展羊痘病毒以 P32 蛋白为主及其他特 异性强、表达量高的基因研究，为进一步解析羊痘 病毒的功能提供依据; 四是开展实施羊痘病毒复制 非必需片段的筛选及更有效的通用载体的构建，开 辟新的研究领域，从而为反刍动物的传染病及其他 动物疾病的有效预防和控制产生深远的影响。5 3亚单位疫苗 在亚单位疫苗的研制过程中，寻找具有较强免疫原性的基因是十分重要的。在羊痘病毒的研究中，P32 蛋白是 CPV 毒株所共有的 且特异性很强的结构蛋白。用它来进行亚单位 疫652014，48( 9) : 61 65 / 施程洪，等中国兽药杂志参考文献:12 王 芳，陈 洪 岩，刘 胜 旺，等 山 羊 痘 病 毒 疫 苗 株 OF64 OF67 的分子特征J 中国预 防 兽 医 学 报，2007，29 ( 2 ) :96 10213 Mangana V O，Vougiouka O，Markoulatos P，et al Sheep pox virus identification by PC in cell cultures J Virol Methods，1999，77: 75 7914 罗 阿 东，唐 源，文 明，等 山 羊 痘 病 毒 SYB Green 荧 光PC 检测方 法 的 建 立J 山地农业生物学报，2008，27( 6) : 503 50715 Hong Tian，Yan Chen，Jinyan Wu，et al Serodiagnosis of sheeppox and goatpox using an indirect ELISA based on synthetic peptide targeting for the major antigen P32J Virology Journal，2010，7: 245 24816 ao T V S，Nandi Evalution of immunocaputure ELISA for diagnosis of goatpoxJ Acta Virologica，1997，41: 345 34817 Sedhukhan T，Nag N C Application of dot ELISA in the diagno- sis of goatpox outbreak Indian Veterinary JournalJ Indian Veterinary Journal，1998，75: 841 84218 Mangana Vougiouka O，Marloulatous P Sheeppoxvirus identifica- tion form clinical specimens by PC，Immu nofluorescence and agar gel immunoprecipitation assay Molecular and Cellular ProbesJ Cell Culture，2000，14: 305 31019 Lamien C E eal time PC method for simultaneous detection， quantitation and differentiation of Capripox virusesJ Virol Methods，2011，171: 134 14020 Lamien C E，Lelenta M，Goger W，et al eal time PC method for simultaneous detection， quantitation and differentiation of capripoxvirusesJ Virol Methods，2011，171: 134 14021 Balinsky C A，Delhon G，Smoliga G，et al apid preclinical detection of Sheeppox virus by a real time PC assayJ Clin Microbiol，2008，46( 7) : 438 44222 Khalil Zro，Fathiah Zakham，Marouane Melloul，et al A sheep- pox outbreak in Morocco: isolation andidentifi cation of virus re- sponsible for the newclinical form of diseaseJ BMC Veterinary esearch，2014，10: 31 3823 熊 毅，朱 伟，刘 棋，等 山羊痘病毒 P32 基因跨膜区缺失 载体的构建与表 达J 农业生物技术学报，2008，16 ( 3 ) :385 38724 王家鹏，唐 静，刘 柳，等 羊痘病毒研究综述J 现代农 业科技，2010，14: 291 292( 编 辑: 侯向辉)1Tao Zhou，Huaijie Jia，Guohua Chen，et al Phylogenetic analysisof Chinese sheep pox and goat pox virus isolatesJ Virology，2012，9: 25 32Hong Tian，Yan Chen，inyan Wu，et al Serodiagnosis of sheep pox and goat pox using an indirect ELISA based on synthetic peptide targeting for the major antigen P32 J Virology，2010，7: 245 248史宗勇，史新涛，袁建琴，等 羊痘研究进展J 中国畜牧 兽医，2011，38( 1) : 186 188Yan X，Wu G，Li J，et al The Analysis on Epidemic Situationof Capripox in ChinaJ Chinese Agricultural Science Bulletin，2010，26( 24) : 6 9Bhanuprakash V，Venkatesan G，Balamurugan V，et al Pox outbreaks in sheep and goats at Makhdoom ( Uttar Pradesh ) ， India: evidence of sheeppox virus infection in goats J Transbo