八年制分子生物考试总结.doc

二基因：储存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息，以及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列所构成的遗传单位。结构基因：基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列。基因组：细胞或生物体中一套完整单倍体的遗传物质的总称原核生物的结构基因：是连续的，RNA合成不需要剪接加工。真核生物结构基因：由外显子和内含子组成，编码序列不连续，为断裂基因顺式作用元件：1.启动子和上游启动子元件2.反应元件3.增强子4.Poly(A)加尾信号病毒基因组：1.不同病毒基因组大小相差较大2. 不同病毒基因组可以是不同结构的核酸3. 除逆转录病毒外，为单倍体基因组4. 病毒基因组有的是连续的，有的分节段5. 有的基因有内含子6. 病毒基因组大部分为编码序列7. 功能相关基因转录为多顺反子mRNA8. 有基因重叠现象原核生物基因组的结构特点：1. 基因组由一条环状双链DNA组成； 2. 只有一个复制起始点；3. 大多数结构基因组成操纵子结构；4. 结构基因无重叠现象；5. 无内含子，转录后不需要剪接；6. 基因组中编码区大于非编码区7. 重复基因少，结构基因一般为单拷贝，rRNA的基因有多拷贝；8. 有编码同工酶的等基因； 9. 基因组中存在可移动的DNA序列；10.非编码区主要是调控序列真核基因组的结构特点：1. 每一种真核生物都有一定的染色体数目；2. 远大于原核基因组，结构复杂，基因数；3. 真核生物基因转录为单顺反子；4. 有大量重复序列; 5. 真核基因为断裂基因; 6. 非编码序列多于编码序列; 7. 功能相关基因构成各种基因家族。五基因表达：生物基因组中结构基因所携带的遗传信息，经过转录、翻译等一系列过程，合成具有特定的生物学功能和生物学效应的蛋白质的全过程。基因表达的调控 ：机体各种细胞内相同的结构基因，根据机体的生长、发育、繁殖及环境变化的需要，有规律的选择性、程序性、适度地表达，以适应环境，发挥其生理功能。乳糖操纵子的调控机制：1.乳糖操纵子的负调控 2.乳糖操纵子的结构3.乳糖操纵子的正调控 4.乳糖操纵子的复合调控 操纵子：由多顺反子转录单位与其调控序列构成多顺反子：多个功能相关的结构基因串联成一个转录单位，由同一调控序列进行转录调节从而实现协同表达反式作用因子：能识别和结合特定的顺式作用元件,并影响基因转录的一类蛋白质或RNA。顺式作用元件：能影响基因表达，但不编码RNA和蛋白质的DNA序列。原核生物基因转录起始的调控机制：1.0因子与转录起始的调控2.转录起始的负调控3.转录起始正调控4.复合调控真核生物转录水平的调控机制：1.反式作用因子的活性调节2.反式作用因子作用方式：成环、扭曲、滑动、oozing 3.反式作用因子的组合式调控 转录后水平的调控：1. 5端加帽和3端多聚腺苷酸化保护mRNA在转录过程中不被降解2. mRNA的选择性剪接六DNA修复：DNA修复是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新执行原来的功能，但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这种DNA的损伤而能继续生存。碱基切除修复：指切除和替换由内源性化学物作用产生的DNA碱基损伤, 是切除修复的一种。核苷酸切除修复：主要修复可影响碱基配对而扭曲双螺旋结构的DNA损伤，修复时切除含有损伤碱基的那一段 DNA重组修复：根据 DNA 末端连接需要的同源性，分为同源重组修复：需要多种蛋白参与,在 S/G2期起主要作用。非同源末端连接：DNA分子之间不需要广泛的同源性，在G1/G0期起主要作用。 SOS修复：正在复制的DNA聚合酶可能遇到尚未修复的DNA损伤，即使细胞不能修复这些损伤，自动防故障系统能够使复制体绕过损伤部位，这一机制就是跨损伤DNA合成。7：双脱氧末端终止法原理：DNA合成反应中，ddNTP不存在3-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5-磷酸基团形成3，5-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP 。测序步骤： 单链DNA模板的制备 DNA模板与测序引物退火 掺入法标记反应 延伸-终止反应 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影 阅读测序结果核酸分子杂交原理：标记的单链核酸探针与待检测的靶单链DNA或RNA局部互补结合形成杂交双链。 应用：核酸靶DNA或RNA序列的定性与定量分析。 Southern印迹杂交原理：将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程应用：DNA（基因组DNA）分子的定性或定量分析。Southern印迹杂交基本过程 ：1. 制备基因组DNA 2. 用限制性内切核酸酶消化基因组DNA 3. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段4. 凝胶预处理5. Southern 印迹转移 6. 标记核酸探针、探针与DNA片段杂交7. 杂交结果显示 Northern印迹杂交：指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。 可以对mRNA进行定性和定量分析基因芯片和微阵列：基因芯片上的阵列是由有规则排列的cDNA或寡核苷酸等样本所组成的 。DNA微阵列：寡核苷酸微阵列（oligomicroarray） cDNA微阵列（cDNA microarray）在一微小的基片（硅片等）表面集成了大量分子识别探针，能够平行分析大量基因转录表达，因此又被称为cDNA芯片。DNA芯片技术的主要应用：基因组分析及发现新的基因 基因表达的研究DNA序列分析 基因诊断和基因药物设计Western免疫印迹：Western blot原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。 PCR技术原理：聚合酶链式反应(PCR) : PCR是模拟天然DNA复制过程，利用DNA 聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。 其主要热循环过程为：变性、退火、延伸三个步骤。平台效应（plateau effect）：PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入线性增长期或静止期，即平台效应。RT-PCR (reverse transcription PCR)：以mRNA为模板逆转录合成cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应。 实时荧光定量RT-PCR Real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR ：PCR扩增指数期内极小的扩增效率改变会极大地影响产量。 应用：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。8:限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） ：能从双链DNA内部特异位点识别并且裂 解磷酸二酯键, 生成寡/寡聚核苷酸 。 核酸外切酶(exonucleases)从多核苷酸链的一端开始按序催化水解磷酸二酯键，降解核苷酸, 产生单个的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。 逆转录酶（reverse transcriptase）是一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA， 合成方向为53，无35外切酶活性。用于以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。 载体 (vector):将外源DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒等。 质粒（plasmid）： 质粒是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。特点：（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。（2）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。 （3）具有一个以上的遗传标志，（4）能自我复制基因克隆基本过程：制备目的基因和相关载体；将目的基因和有关载体进行连接；将重组的DNA分子导入受体细胞；DNA重组体的筛选和鉴定；DNA重组体的扩增、表达和其他研究。 真核细胞转染：将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞 。 研究基因功能、基因表达调控、突变分析和蛋白质生产。真核细胞转染的方法与基本原理：（一）磷酸钙沉淀法（calcium phosphate co-precipitation）使外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙混合，形成微小颗粒，并加入到宿主细胞中，使这些颗粒沉积在细胞表面，以利于宿主细胞摄取这些颗粒。 （二）电穿孔法（electroporation）：是一种将外源DNA导入宿主细胞的常用方法。操作时将外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流的作用下，细胞膜出现许多小孔，使外源DNA能进入宿主细胞，并整合至宿主细胞基因组中，以建立稳定的转化细胞株。（三）DEAE-葡聚糖（ DEAE-Dextran）法：外源DNA或重组质粒DNA与DEAE葡聚糖混合，DEAE葡聚糖带有大量正电荷的化学基团，可与DNA中带负电荷磷酸基团结合，并粘附于细胞表面，借助细胞内吞过程促进外源DNA进入细胞。此法简单、快速、有效，常用于外源基因的短暂表达研究。 （四）脂质体（liposome）介导的基因导入：利用脂质体将外源基因导入到真核细胞。其原理是阳离子脂质体与DNA混合后，形成一种稳定的复合物。这种复合物可直接加到培养的细胞中，然后粘附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释放到胞浆中。这种温和的基因转移的方法，对细胞无损伤，因而其转移效率高 （五）显微注射法（microinjection）：在制备转基因动物时，将外源基因通过毛细玻璃管，在显微镜下直接注射到受精卵的细胞核内。转染细胞的筛选：( 一) TK-细胞突变株筛选转染细胞（二）药物筛选转染细胞大肠杆菌表达的基本要素：1目的基因和密码子 ：目的基因如果来自真核细胞必须是cDNA 。cDNA的起始密码子（ATG）上游部分（5端非编码区）必须除去。对于一些分泌性蛋白，还应除去信号肽部分。2载体的选择 3目的基因与载体的连接：（1）起始密码子：以限制酶Nde I或Nco I 位点引入ATG。 （2）融合蛋白（fusion protein）4受体菌株和诱导条件 (1)根据载体所携带的启动子选择特定的菌株(2)诱导表达 5.表达蛋白的种类(1) 分泌型异源蛋白的表达(2)包涵体及其性质 6.分离、纯化表达产物 11基因突变的多种类型：点突变是单个碱基的替换：转换和颠换 缺失是一个或多个核苷酸的丢失 插入是一个或多个核苷酸的增加 倒位是一段核苷酸序列染色体位置的改变基因突变还分为配子突变与体细胞突变 动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变基因突变的遗传效应：1. 错义突变（missense mutation）指DNA改变后mRNA中相应密码子发生改变，编码另一种氨基酸，使蛋白质中的氨基酸发生改变。 2.无义突变 (nonsense mutation) 3.同义突变(synonymous mutation)：同义密码子互换性变化, 所编码的氨基酸不变。 4.移码突变(frame-shift mutation) 1)密码子缺失或插入 2)整个基因或基因大片段缺失 5.融合突变(fusion mutation)细胞减数分裂时同源染色体不等交换而致基因间错位配对, 产生两种含不同等位基因的染色体。基因结构和表达与疾病的研究策略：1.通过基因结构分析确定基因变异 2.基因表达水平分析：差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析 3.通过功能学研究确定致病基因：转基因技术（指在生物基因组中带有插入或整合的外源基因，生物个体能将它传给后代，并表达出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状）、基因敲除、反义技术、RNA干扰技术（双链RNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因表达沉默，产生相应功能表型的缺失现象）、基因诱导超表达 12基因诊断的概念：在基因水平上，运用PCR、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因的存在、结构和表达状态正常与否，从而对相关疾病进行诊断的过程。基因诊断的特点：高特异性：诊断目标 高灵敏度：分子生物学方法 早期诊断性：分子遗传学规律 应用广泛性：疾病与非疾病检查基因诊断的常用技术：Southern印迹杂交 限制性酶谱分析 限制性片段长度多态性分析寡核苷酸探针杂交 PCR及其衍生技术 DNA芯片技术13基因治疗：将遗传物质(基因DNA或RNA)转移入机体细胞，