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文档简介

PCR技术原理 厦门艾德生物医药科技有限公司 定义 PCR技术又称聚合酶链式反应 polymerasechainreaction 是通过模拟体内DNA复制的方式 在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术 PCR技术 DNA的变性在某些理化因素作用下 DNA分子内碱基对之间的氢键断裂 使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程 DNA的复性在适当条件下 变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性 此过程称为退火 annealing DNA的特性 最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段 不耐高温 TaqDNA多聚酶的发现1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 thermusaquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶 PCR的发展 DNA样品的变性引物的退火引物的延伸 普通PCR原理 PCR反应要素 缓冲液 起PCR反应的缓冲体系Mg2 Mg2 浓度过高 反应特异性降低 出现非特异扩增 浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性 使反应产物减少dNTP dNTP能与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度降低引物 引物是PCR特异性反应的关键酶 浓度过高可引起非特异性扩增 浓度过低则合成产物量减少模板 模板核酸的量与纯化程度 是PCR成败与否的关键环节之一 引物是PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上 只要知道任何一段模板DNA序列 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物 用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增设计原则引物长度 引物扩增跨度 引物G C含量 TM值 引物的特异性 引物量 引物 PCR反应条件 温度变性温度 双链DNA在90 95 变性退火温度 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素延伸温度 延伸温度 一般选择在70 75 之间时间 时间过长会导致非特异性扩增循环次数 循环次数越多 非特异性产物的量亦随之增多 PCR结果的分析 普通PCR跑电泳分析荧光定量PCR real timePCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针 对PCR产物进行标记跟踪 实时在线监控反应过程 结合相应的软件可以对结果进行分析 计算待测样品的初始模板量 内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针Taqman探针MolecularBeacons分子信标蝎子引物探针双环探针 激发光 发射光 SYBR GreenI染料 TaqMan探针 分子信标探针 英国DxS蝎子探针技术
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