第七章 分光光度法ppt课件

第七章 分光光度法 分光光度法是一种基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法 是生命科学中最常用的分析技术之一 包括 1 可见分光光度法 2 紫外 可见分光光度法 主要 3 红外光谱法等 分光光度法 AbsorptionPhotometry 特点 一 灵敏度高 分光光度法测定物质的浓度下限 最低浓度 一般可达1 10 3 的微量组分 对固体试样一般可测到10 4 10 5 的痕量组分 如果对被测组分事先加以富集 灵敏度还可以提高1 2个数量级 一般分光光度法的相对误差为2 5 若使用精密仪器 相对误差可降至1 2 其准确度虽不如滴定分析法及重量法 但对微量成分来说 还是比较满意的 因为在这种情况下 滴定分析法和重量法准确度更差 甚至无法进行测定 二 准确度较高 三 操作简便 测定速度快 四 应用广泛 几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用分光光度法进行测定 不仅用于定量分析 也可用于某些有机物的定性分析 还可用于某些物理化学常数及络合物组成的测定 物质对光的选择性吸收 第一节 一 光的基本性质 1 光的基本性质光是一种电磁波 具有波粒二象性 其波长 频率与速度之间的关系为 普朗克方程h 普朗克常数 其值为6 63 10 34J s普朗克方程表示光的波动性与粒子性之间的关系 波长越长 能量越低 波长越短 能量越高 2 单色光和复合光 1 单色光 指波长处于某一范围的光 2 复合光 由不同单色光组成的光 例如 阳光和白炽灯发出的光均为复合光 3 电磁波谱 表10 1电磁波谱 1m 106 m 109nm 1010 4 可见光和互补光 1 可见光 指人的眼睛所能感觉到的光 波长范围为 400 750nm 的电磁波 2 互补光 将两中适当颜色的光按一定的强度比例混合 如果能形成白光 这两种光称为互补光 图10 1光的互补色示意图 nm 二 物质对光的选择性吸收 如果我们把具有不同颜色的各种物体放置在黑暗处 则什么颜色也看不到 可见物质呈现的颜色与光有着密切的关系 一种物质呈现何种颜色 是与光的组成和物质本身的结构有关的 一 物质对光产生选择性吸收的原因 当光通过透明物体时 光子是否被物质吸收 取决于 光子所具有的能量 物质的内部结构 由于不同物质的分子其结构和组成不同 它们所具有的特征能级也不同 故能级差也不同 物质对光的吸收具有选择性 在可见光区 不同波长的光具有不同的颜色 当一束阳光 白光 通过棱镜后就色散成红 橙 黄 绿 等颜色的光 这些光具有不同的波长 所以不同颜色光 其波长不同 物质的颜色正是由于他们对不同波长的光具有选择性吸收而产生的 当一束白光通过某一物质或溶液时 由于物质对光的选择性吸收 某些波长的光被吸收 另一些波长的光则不被吸收而透过溶液 二 物质的颜色与光吸收的关系 溶液的颜色由透过光的波长所决定 1 如果物质把各种波长的光完全都吸收 则呈现黑色 2 如果完全反射 则呈现白色 3 如果透过所有的光 则为无色透明溶液 4 如果对各种波长的光吸收程度差不多 则呈现灰色 5 如果物质选择性地吸收某些波长的光 那么 这种物质的颜色就由它所反射或透过光的颜色来决定 例如 CuSO4溶液 实验证明 CuSO4溶液浓度越高 对黄色光的吸收越多 表现为透过的蓝色越强 溶液的蓝色也越深 1 用不同波长 400 720nm 的光 照射某一吸光物质的溶液 2 测吸光度 A 3 以 A作图 得一曲线直观地表示出物质对光的吸收特征 三 吸收曲线 图10 2KMnO4溶液的吸收曲线 cKMnO4 a b c d 结论 1 某物质的吸收光谱表明了该物质对不同波长的光的吸收能力的分布情况 2 C A 即光的吸收程度越大3 最大吸收处只有一个 称为最大吸收波长 即 同一物质 只有一个最大吸收峰 即最大吸收波长是固定不变的 该峰对应的波长叫 max KMnO4溶液的 max 525nm 定量测定时 必须用 max的光照射 不同物质 其内部结构不同 则吸收曲线不同 max不同 max只与物质的种类有关 而与浓度无关 任何可见光区内 溶液的颜色主要是由 max决定 第二节 光吸收的基本定律 一 朗伯 比耳定律 1 布格 Bouguer 和朗伯 Lambert 先后在1729年和1760年阐明了物质对光的吸收程度与吸收层厚度之间的关系 2 比耳 beer 与1852年又提出光的吸收程度与吸光物质浓度之间也有类似的关系 3 二者结合起来就得到了朗伯 比耳定律 4 该定律奠定了分光光度分析法的理论基础 当一束平行单色光照射到任何均匀 非散射的介质 固体 液体或气体 例如 溶液时 光的一部分被介质吸收 一部分透过溶液 一部分被器皿的表面反射 则它们之间的关系为 一 朗伯 比耳定律的推导 入射光的强度为I0 吸收光的强度为Ia 透过光的强度为It 反射光的强度为Ir 如果 I0 Ia It Ir 近似处理 在分光光度测定中 盛溶液的比色皿都是采用相同材质的光学玻璃制成的 反射光的强度基本上是不变的 一般约为入射光强度的4 其影响可以互相抵消 于是可以简化为 I0 Ia It 推导 纯水对于可见光的吸收极微 故有色液对光的吸收完全是由溶液中的有色质点造成的 当入射光的强度I0一定时 如果Ia越大 It就越小 即透过光的强度越小 表明有色溶液对光的吸收程度就越大 I0 Ia It 实验证明 实践证明 有色溶液对光的吸收程度 与该溶液的浓度 液层的厚度以及入射光的强度等因素有关 如果保持入射光的强度不变 则光吸收程度与溶液的浓度和液层的厚度有关 1760年由朗伯推导出了吸光度于吸收介质厚度的关系式 1 朗伯定律 2 比耳定律 比耳 beer 在1852年提出光的吸收程度与吸光物质浓度之间的关系 3 朗伯 比耳定律 如果同时考虑溶液的浓度和液层厚度的变化 则上述两个定律可合并为朗伯 比耳定律 即得到 式中 A 吸光度 K 比例常数 与入射光的波长 物质的性质和溶液的温度等因素有关 It I0 T 透射比 透光度 b 液层厚度 cm 光吸收定律的数学表达式 4 朗伯 比耳定律物理意义 当一束平行的单色光垂直通过某一均匀的 非散射的吸光物质溶液时 其吸光度 A 与溶液液层厚度 b 和浓度 c 的乘积成正比 它不仅适用于溶液 也适用于均匀的气体 固体状态 是各类光吸收的基本定律 也是各类分光光度法进行定量分析的依据 5 朗伯 比耳定律成立的前提 1 入射光为平行单色光且垂直照射 2 吸光物质为均匀非散射体系 3 吸光质点之间无相互作用 4 辐射与物质之间的作用仅限于光吸收 无荧光和光化学现象发生 6 吸光度的加和性 当介质溶液中含有多种吸光组分时 只要各组分间不存在着相互作用 则在某一波长下介质的总吸光度是各组分在该波长下吸光度的加和 即 A A1 A2 An 二 吸收系数和桑德尔灵敏度 1 吸收系数 朗伯 比尔定律 A Kbc 中的系数 K 因浓度 c 所取的单位不同 有两种表示方式 当c g L 1b cm时K用a表示 称为吸收系数 其单位为L g 1 cm 1 这时朗伯 比耳定律变为 A abc 1 吸收系数 a 2 摩尔吸收系数 当c mol L 1 b cm时K用 表示 称为摩尔吸收系数 其单位为L mol 1 cm 1 这时朗伯 比耳定律变为 A bc 摩尔吸收系数 的物理意义 当吸光物质的浓度为1mol L 1 吸收层厚度为1cm时 吸光物质对某波长光的吸光度 摩尔吸收系数 的性质 表示了吸光物质的浓度为1mol L 1 液层厚度为1cm 物质对光的吸收能力 与溶液的浓度和液层厚度无关 只与物质的性质及光的波长等有关 在波长 温度 溶剂等条件一定时 的大小取决于物质的性质 是吸光物质的特征常数 不同物质具有不同的 对于同一物质 当其他条件一定时 温度等 的大小取决于波长 f 能表示物质对某一波长的光的吸收能力 越大 表明物质对某 的光吸收能力越强 当 为 max 为 max max是一重要的特征常数 它反映了某吸光物质吸收能力可能达到的最高度 常用来衡量光度法灵敏度的高低 max越大 表明测定该物质的灵敏度越高一般认为 max 104L mol 1 cm 1的方法较灵敏 所以书写 时应标明波长 目前最大的 的数量级可达106如 Cu 双流腙配合物 495 1 5 105L mol 1 cm 1 3 吸收系数 a 与摩尔吸收系数 的关系 吸收系数 a 常用于化合物组成不明 相对分子质量尚不清楚的情况 摩尔吸收系数 的应用更广泛 aM 2 桑德尔灵敏度 Sandell S 吸光光度法的灵敏度除用摩尔吸收系数 表示外 还常用桑德尔灵敏度S表示 定义 当光度仪器的检测极限为A 0 001时 单位截面积光程内所能检出的吸光物质的最低质量单位 g cm 2 3 桑德尔灵敏度 S 与摩尔吸收系数 的关系 由桑德尔灵敏度S的定义可得到 A 0 001 bc S单位 g cm 2 b cmc mol L 1 mol 103cm3 bc mol 103cm2 1 若再乘以M g mol 1 则为103cm2的截面积光程中所含物质的质量 g 2 若再乘已106 则 g 把变成了 g 例题 用邻二氮菲分光光度法测铁 已知溶液中Fe2 的浓度为500 g L 1 液层厚度为2cm 在508nm处测得透射比为0 645 计算 吸光系数a 摩尔吸收系数 桑德尔灵敏度S MFe 55 85g mol 1 解 A lgT lg0 645 0 190 三位有效数字 c 500 g L 1 5 00 10 4g L 1b 2cm 三 标准曲线的绘制及应用 1 标准曲线配制一系列已知浓度的标准溶液 在确定的波长和光程等条件下 分别测定系列溶液的吸光度 A 然后以吸光度为纵坐标 以浓度 c 为横坐标作图 得到一条曲线 称标准曲线 也称做工作曲线 2 标准曲线的应用 1 曲线的斜率为 b 由于b是定值 由此可得到摩尔吸收系数 2 可根据未知液的Ax 在标准曲线上查出未知液的浓度cx A bc 二 引起偏离朗伯 比耳定律的原因 根据郎伯 比尔定律 当吸收层厚度不变时 标准曲线应当是一条通过原点的直线 即A与c成正比关系 称之为服从比尔定律 但在实际测定中 标准曲线会出现向浓度轴弯曲 负偏离 和向吸光度轴弯曲 正偏离 这种现象称为对郎伯 比尔定律的偏离 一 物理因素 1 单色光不纯所引起的偏离 严格地讲 朗伯 比耳定律只对一定波长的单色光才成立 但在实际工作中 目前用各种方法得到的入射光并非纯的单色光 而是具有一定波长范围的单色光 那么 在这种情况下 吸光度与浓度并不完全成直线关系 因而导致了对朗伯 比耳定律的偏离 2 非平行入射光引起的偏离 非平行入射光将导致光束的平均光程b 大于吸收池的厚度b 实际测得的吸光度将大于理论值 从而产生正偏离 3 介质不均匀引起的偏离 朗伯 比耳定律是建立在均匀 非散射基础上的一般规律 如果介质不均匀 呈胶体 乳浊 悬浮状态存在 则入射光除了被吸收之外 还会有反射 散射作用 在这种情况下 物质的吸光度比实际的吸光度大得多 必然要导致对朗伯 比耳定律的偏离 产生正偏离 二 化学因素 1 溶液浓度过高引起的偏离 朗伯 比耳定律是建立在吸光质点之间没有相互作用的前提下 但当溶液浓度较高时 吸光物质的分子或离子间的平均距离减小 从而改变物质对光的吸收能力 即改变物质的摩尔吸收系数 浓度增加 相互作用增强 导致在高浓度范围内摩尔吸收系数不恒定而使吸光度与浓度之间的线性关系被破坏 2 化学反应引起的偏离 溶液中吸光物质常因解离 缔合 形成新的化合物或在光照射下发生互变异构等 从而破坏了平衡浓度与分析浓度之间的正比关系 也就破坏了吸光度A与分析浓度c之间的线性关系 产生对朗伯 比耳定律的偏离 第三节 吸光光度法的仪器 第四节 吸光光度法分析条件的选择 包括 1 反应条件 2 测量条件 一 显色反应及其条件的选择 一 显色反应和显色剂显色反应 将被测组分转变为有色化合物的反应称为 显色剂 能与被测组分反应使之生成有色物质的试剂称为 1 显色反应 显色反应可分两大类 1 络合反应例如 邻二氮菲与Fe2 络合使得本来颜色很浅的Fe2 转变为红色邻二氮菲亚铁络合物 络合反应是最主要的显色反应 2 氧化还原反应例如 用过硫酸胺将接近无色的Mn2 氧化为紫色的MnO4 选择显色剂和显色反应的一般标准 一种被测组分究竞应该用哪种显色剂和显色反应 可根据所需标准加以选择 1 选择性要好 一种显色剂最好只与一种被测组分起显色反应 这样干扰就少 或者干扰离子容易被消除 或者显色剂与被测组分和干扰离子生成的有色化合物的吸收峰相隔较远 2 灵敏度要高 由于吸光光度法一般是测定微量组分的 灵敏度高的显色反应有利于微量组分的测定 灵敏度的高低可从摩尔吸光系数值的大小来判断 值大灵敏度高 否则灵敏度低 但应注意 灵敏度高的显色反应 并不一定选择性就好 对于高含量的组分不一定要选用灵敏度高的显色反应 3 对比度要大 即如果显色剂有颜色 则有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要大 一般要求在60nm以上 4 有色化合物要稳定 组成要恒定 有色化合物的组成若不确定 测定的重现性就较差 有色化合物若易受空气的氧化 日光的照射而分解 就会引入测量误差 这样可以保证测量结果有良好的重现性和足够高的准确度 实验条件也易于控制 5 显色反应的条件要易于控制 如果条件要求过于严格 难以控制 测定结果的重现性就差 2 显色剂 常用的显色剂主要有两大类 1 无机显色剂 2 有机显色剂 1 无机显色剂 许多无机试剂能与金属离子起显色反应 如Cu2 与氨水形成深蓝色的络离子Cu NH4 42 SCN 与Fe3 形成红色的络合物Fe SCN 2 或Fe SCN 63 等 但是多数无机显色剂的灵敏度和选择性都不高 其中性能较好 目前还有实用价值的有硫氰酸盐 钼酸铵 氨水和过氧化氢等 2 有机显色剂 许多有机试剂 在一定条件下 能与金属离子生成有色的金属螯合物 具有环状结构的络合物 有机显色剂与金属离子能形成稳定的 具有特征颜色的螯合物 其灵敏度和选择性较高 是光度分析中研究最多 应用最广的一类显色剂 金属螯合物应用于光度分析的优点 1 大部分金属螯合物都呈现鲜明的颜色 摩尔吸光系数大于104 因而测定的灵敏度很高 2 金属螯合物都很稳定 一般离解常数都很小 而且能抗辐射 3 专用性强 绝大多数有机整合剂 在一定条件下 只与少数或其一种金属离子络合 而且同一种有机螯合剂与不同的金属离子络合时 生成具有特征颜色的螯合物 4 虽然大部分金属螯合物难溶于水 但可被萃取到有机溶剂中 大大发展了萃取光度法 5 在显色分子中 金属所占的比率很低 提高了测定的灵敏度 因此 有机显色剂是光度分析中应用最多最广的显色剂 寻找高选择性 高灵敏度的有机显色剂 是光度分析发展和研究的重要内容 有机化合物为什么有颜色 主要由其结构决定 即其结构具有特殊的生色基团和助色基团 有机显色剂的结构 生色团 在有机化合物分子中 凡是包含有共轭双键的基团如 N N N O NO2 对醌基 C O 羰基 C S 硫羰基 等 一般都具有颜色 原因是这些基团中的 电子被光激发时 只需要较小的能量 能吸收波长大于200nm的光 因此 称这些基团为生色团 助色团 某些含有未共用电子对的基团如胺基 NH2 RHN R2N 具有一对未共用电子对 羟基 OH 具有两对末共用电子对 以及卤代基 F Cl Br I等 它们与生色基团上的不饱和键互相作用 引起永久性的电荷移动 从而减小了分子的活化能促使试剂对光的最大吸收 红移 向长波方向移动 使试剂颜色加深 这些基团称为助色团 含有生色基团的有机化合物常常能与许多全属离子化合生成性质稳定且具有特征颜色的化合物 且灵敏度和选择性都很高 这就为用光度法测定这些离子提供了很好的条件 有机显色剂的种类很多 常用的有 1 邻二氮菲2 双硫腙3 二甲酚橙4 偶氮胂III5 铬天青S 常用的有机显色剂 二 显色反应条件的选择 显色反应能否完全满足光度法的要求 除了与显色剂的性质有主要关系外 控制好显色反应的条件也是十分重要的 如果显色条件不合适 将会影响分析结果的准确度 1 显色剂的用量 显色就是将被测组分转变成有色化合物 表示 M R MR 被测组分 显色剂 有色化合物 反应在一定程度上是可逆的 为了减少反应的可逆性 根据同离子效应 加入过量的显色剂是必要的 但也不能过量太多 否则会引起副反应 对测定反而不利 合适的加入量由实验确定 显色剂的用量的实验确定 1 配置一系列固定了被测组分的浓度和其它条件 只有加入的显色剂量不同的测试溶液 2 测其吸光度 3 以吸光度A对显色剂c作图 试液吸光度与显色剂浓度的关系曲线 A随c的增加而增大 曲线出现平台 这是显色剂浓度的选择范围 A随c的增加而增大而又下降 曲线出现最大值 这是显色剂浓度的选择范围 A随c的增加而不断增大 曲线不出现平台 这时必须严格控制显色剂用量 2 溶液的酸度 溶液酸度对显色反应的影响很大 这是由于溶液的酸度直接影响着金属离子和显色剂的存在形式以及有色络合物的组成和稳定性 因此 控制溶液适宜的酸度 是保证光度分析获得良好结果的重要条件之一 1 酸度对被测物质存在状态的影响 大部分高价金属离子都容易水解 当溶液的酸度降低时 会产生一系列羟基络离子或多核羟基络离子 高价金属离子的水解象多元弱酸的电离一样 是分级进行的 随着水解的进行 同时还发生各种类型的聚合反应 聚合度随着时间增大 而最终将导致沉淀的生成 显然 金属离子的水解 对于显色反应的进行是不利的 故溶液的酸度不能太低 2 酸度对显色剂浓度和颜色的影响 光度分析中所用的大部分显色剂都是有机弱酸 显色反应进行时 首先是有机弱酸发生离解 其次才是络阴离子与金属离子络合 M HR MR H 从反应式可以看出 溶液的酸度影响着显色剂的离解 并影响着显色反应的完全程度 当然 溶液酸度对显色剂离解程度影响的大小 也与显色剂的离解常数有关 Ka大时 允许的酸度可大 Ka很小时 允许的酸度就要小些 故溶液的酸度不能太高 例如 许多显色剂本身就是酸碱指示剂 当溶液酸度改变时 显色剂本身就有颜色变化 如果显色剂在某一酸度时 络合反应和指示剂反应同时发生 两种颜色同时存在 就无法进行光度测定 例如 二甲酚橙在溶液的pH 6 3时呈红色 在pH 6 3时呈柠檬黄色 在pH 6 3时 呈中间色 故pH 6 3时 是它的变色点 而二甲酚橙与金属离子的络合物却呈现红色 因此 二甲酚橙只有在pH 6的酸性溶液中可作为金属离子的显色剂 如果在pH 6的酸度下进行光度测定 就会引入很大误差 对于某些逐级形成络合物的显色反应 在不同的酸度时 生成不同络合比的络合物 例如铁与水杨酸的络合反应 当pH 4 Fe3 C7H4O3 2 1 1 紫色4 pH 9 Fe3 C7H4O3 22 1 2 红色pH 9 Fe3 C7H4O3 32 3 1 3 黄色在这种情况下 必须控制合适的酸度 才可获得好的分析结果 3 对络合物组成和颜色的影响 1 时间显色反应的速度有快有慢 大多数显色反应速度较慢 需要一定时间 溶液的颜色才能达到稳定程度 有些有色化合物放置一段时间后 由于空气的氧化 试剂的分解或挥发 光的照射等原因 使颜色减退 适宜的显色时间和有色溶液稳定程度 也必须通过实验来确定 实验方法是配制一份显色溶液 从加入显色剂计算时间 每隔几分钟测定一次吸光度 绘制A t曲线 根据曲线来确定适宜的时间 3 时间和温度 不同的显色反应需要不同的温度 一般显色反应可在室温下完成 但是有些显色反应需要加热至一定的温度才能完成 也有些有色络合物在较高温度下容易分解 因此 应根据不同的情况选择适当的温度进行显色 温度对光的吸收及颜色的深浅也有一定的影响 故标样和试样的显色温度应保持一样 合适显色温度也必须通过实验确定 做A T曲线即可求出 2 温度 4 有机溶剂和表面活性剂 溶剂对显色反应的影响表现在下列几方面 1 溶剂影响络合物的离解度 许多有色化合物在水中的离解度大 而在有机溶剂中的离解度小 如在Fe SCN 3溶液中加入可与水混溶的有机试剂 如丙酮 由于降低了Fe SCN 3的离解度而使颜色加深提高了测定的灵酸度 2 溶剂改变络合物颜色 溶剂改变络合物颜色的原因可能是各种溶剂分子的极性不同 介电常数不同 从而影响到络合物的稳定性 改变了络合物分子内部的状态或者形成不同的溶剂化物的结果 3 溶剂影响显色反应的速度 例如 当用氯代磺酚S测定Nb时 在水溶液中显色需几小时 如果加入丙酮后 仅需30分钟 表面活性剂的加入可以提高显色反应的灵敏度 增加有色化合物的稳定性 其作用原理一方面是胶束增溶 另一方面是可形成含有表面活性剂的多元络合物 表面活性剂的使用 共存离子存在时对光度测定的影响有以下几种类型 5 共存离子的干扰及消除 1 与试剂生成有色络合物 如用硅钼蓝光度法测定钢中硅时 磷也能与钼酸铵生成络合物 同时被还原为钼蓝 使结果偏高 2 干扰离子本身有颜色 如Co2 红色 Cr3 绿色 Cu2 蓝色 3 与试剂结合成无色络合物 与试剂结合成无色络合物消耗大量试剂而使被测离子络合不完全 如用水扬酸测Fe3 时 Al3 Cu2 等有影响 4 与被测离子结合成离解度小的另一化合物 如由于F 的存在 能与Fe3 以FeF63 形式存在 Fe SCN 3本不会生成 因而无法进行测定 1 控制酸度控制显色溶液的酸度 是消除干扰的简便而重要的方法 许多显色剂是有机弱酸 控制溶液的酸度 就可以控制显色剂R的浓度 这样就可以使某种金属离子显色 使另外一些金属离子不能生成有色络合物 当溶液的情况比较复杂 或各种常数值不知道时 则溶液最适合的pH值须通过实验方法来确定 消除干扰的方法主要有以下三种 在显色溶液里加一种能与干扰离子反应生成无色络合物的试剂 也是消除干扰的有效而常用的方法 例如 用硫氰酸盐作显色剂测定Co2 时 Fe3 有干扰 可加入氟化物 使Fe3 与F 结合生成无色而稳定的FeF63 就可以消除干扰 在另外的情况下 也可通过氧化 还原反应 改变干扰离子的价态以消除于扰 2 加入掩蔽剂 3 采用萃取光度法 用适当的有机溶剂萃取有色组分 如用丁二酮肟测定钯时 钯与丁二酮肟所形成的内络盐 可被氯仿从酸性溶液中选择性地萃取 许多干扰离子则不被萃取 A 在不同波长下测定两种显色配合物的吸光度 对它们进行同时测定 B 寻找新的显色反应如将二元配合物改变为三元配合物 C 分离干扰离子在没有适当掩蔽剂时 干扰离于可用电解法 淀法或离子交换法等分离除去 D 还可以通过选择适当的测量条件 消除干扰离子的影响 4 其它方法 二 吸光光度法的测量误差及测量条件的选择 光度分析法的误差来源有两方面 1 是各种化学因素所引入的误差 2 是仪器精度不够 测量不准所引入的误差 1 仪器测量误差 是指在测量吸光度或透射比时所产生的误差 任何光度计都有一定的测量误差 一 仪器测量误差 2 仪器测量误差的来源 仪器测量误差的来源是多方面的 1 光源的发光强度不稳定 2 光电效应的非线性 电位计的非线性 3 杂散光的影响 滤光片或单色器的质量差 谱带过宽 4 比色皿的透光率不一致 透光率与吸光度的标尺不准等因素 对给定的光度计来说 透光率或吸光度的读数的准确度是仪器精度的主要指标之一 也是衡量测定结果准确度的重要因素 3 透射比的读数对浓度误差的影响 光度计主要仪器测量误差是表头透射比的读数误差 光度计的读数标尺上透射比T的刻度是均匀的 故透射比的读数误差 T 绝对误差 与T本身的大小无关 对于一台给定仪器它基本上是常数 一般在0 002 0 01之间 仅与仪器自身的精度有关 读数误差 T 绝对误差 对 c c的影响 根据郎伯 比尔定律 两边微分 将以上两式相除即得浓度测量的相对误差 此式表明由相同的dT T 引起的dc c c c 是不相同的 图10 8 Er T关系图 假定某仪器的dT 0 005 按上式计算出T值不同时dc c的绝对值 Er 并作出相应的 Er T关系曲线 结论 当dT一定 而被测组分分别处于低浓度范围 T大 和高低浓度范围 T小 时 c c均较大 而且曲线有一最低点 光度法的最佳测量范围 1 最佳测量范围 透射比在15 70 吸光度在0 15 0 80范围内 由dT引起的 Er 较小 2 当TlnT达最大值时 Er 最小 令 选择适当的测量条件 是获得准确测定结果的重要途径 选择适合的测量条件 可从下列几个方面考虑 二 测量条件的选择 1 测量波长的选择 由于有色物质对光有选择性吸收 为了使测定结果有较高的灵敏度和准确度 必须选择溶液最大吸收波长的入射光 如果有干扰时 则选用灵敏度低一些 但能避兔干扰的入射光 也能获得比较满意的测定结果 吸光度在0 15 0 80时 测量的准确度较高 为此可以从下列几方面想办法 1 计算而且控制试样的称出量 含量高时 少取样 或稀释试液 含量低时 可多取样 或萃取富集 2 如果溶液已显色 则可通过改变比色皿的厚度来调节吸光度大小 2 吸光度范围的控制 3 参比溶液的选择 参比溶液是用来调节仪器工作零点的 若参比溶液选得不适当 则对测量读数准确度的影响较大 1 纯溶剂空白 选择办法 当试液 试剂 显色剂均在测定波长处无吸收时 可用蒸馏水作参比液 称纯溶剂空白 2 试液空白 试剂和显色剂均无色时 而样品溶液中其他离子有色时 应采用不加显色剂的试液溶液作参比液 称试液空白 3 试剂空白 试剂和显色剂均有颜色时 可将一份试液加入适当掩蔽剂 将被测组分掩蔽起来 使之不再与显色剂作用 然后把显色剂 试剂均按操作手续加入 以此做参比溶液 称试剂空白 第五节 吸光光度法的应用 一 定量分析 一 单组分的测定 1 一般方法 A c标准曲线法 2 示差分光光度法 当被测组分含量高时 常常偏离朗伯 比耳定律 即使不偏离 由于吸光度太大 也超出了准确读数的范围 就是把分析误差控制在5 以下 对高含量成分也是不符合要求的 所以 普通分光光度法只适用于微量或痕量组分的测定 而不适合常量组分 2 5 如果采用示差法 就能克服这一缺点 也能使测定误差降到 0 5 以下 1 示差分光光度法与普通光度法的主要区别 所采用的参比溶液不同 普通 是以c 0的试剂空白为参比 示差 是以一个浓度比待测试液cx稍低的标准溶液cs为参比 调节仪器T 100 A 0 然后测A 2 示差分光光度法的测定原理 据L B定律 在普通 As lgTs bcsAx lgTx bcx在示差 测得的是 A Af cx cs 两式相减得 A Ax As b cx cs b C即 用cs作参比调零 T 100 测得cx吸光度是试液与参比溶液的吸光度差值 由上式可知 两溶液吸光度之差 A与两溶液浓度之差 c成正比 制作 A c标准曲线从中查得 c即可求出其浓度 cx cs c 3 提高测量准确度的原理 示差法相对于普通光度法来说 提高测量准确度的原因是扩展了读数标尺 在普通光度法中 以试剂空白为参比 测得透射比分别为 csTs 10 cxTx 5 在示差法中 以