NK细胞杀伤活性检测

NK细胞杀伤活性检测 乳酸脱氢酶释放法 石河子大学医学院免疫学教研室2013 7 5 目的要求 熟悉乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞杀伤活性的检测方法 原理 乳酸脱氢酶 LDH 是活细胞胞浆内含酶之一 正常情况下 LDH不能透过细胞膜 当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时 细胞膜通透性改变 LDH可释放至介质中 释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中 使氧化型辅酶 NAD 变成还原型辅酶 NADH2 后者再通过递氢体 吩嗪二甲酯硫酸盐 PMS 还原硝基氯化四氮唑蓝 NBT 形成有色的甲臢类化合物 在490nm或570nm波长处有一高吸收峰 利用读取的A值 经过计算即可得知NK细胞杀伤靶细胞的活性 实验原理 效应细胞靶细胞释放LDH 丙酮酸 乳酸 乳酸脱氢酶 LDH NAD NADH H PMS NBT 甲臢 OD570nm 吩嗪二甲酯硫酸盐 硝基氯化四氮唑蓝 试剂 1 靶细胞检测人的NK细胞活性常用的靶细胞为体外传代细胞株K562 2 效应细胞从人外周血 肝素抗凝 分离的单个核细胞 3 1640培养液4 LDH底物溶液 临用前配制 NBT硝基氯化四氮唑蓝4mgNAD I氧化型辅酶I10mgPMS吩嗪二甲酯硫酸盐1mg 试剂 加蒸馏水2ml溶解 混匀后取上清液1 6ml 加1mol L乳酸钠0 4ml 然后加入0 1mol LpH7 4PBS至10ml 5 1 NP 40 取1mlNP 40加去离子水99ml 6 1mol L柠檬酸终止液取柠檬酸21g加去离子水100ml 实验步骤 效应细胞的制备 分离外周血单个核细胞 靶细胞的制备 效 靶细胞相互作用 酶促反应 结果判读 取培养24 48hr的靶细胞 K562 洗涤3次 1000rpm 10min 最后用完全RPMI 1640培养液调整细胞浓度至1 105 ml 备用 靶细胞的制备 效应细胞的制备 分离外周血单个核细胞 采集静脉血4ml 加0 2ml肝素溶液 125 250U ml 抗凝 分别吸取2ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中 将管倾斜45 沿管壁缓缓注入抗凝血 离心2000rpm 20min 密度梯度离心分离淋巴细胞亚群 用完全RPMI 1640定容细胞 计数后调整细胞浓度 加入0 2ml完全RPMI 1640 混匀 1x107 将所得PBMC用5倍体积的1640洗涤一次2000rpm 10min 计数PBMC 1 计数4个大方格中 即64个小方格 所有细胞数2 计数原则 数上不数下 数左不数右 3 总数除以4 所得数据 104即为1ml液体中的细胞总数4 每ml健康成人血可分离出1 106 2 106个单个核细胞 计数PBMC举例 数4个大方格细胞数分别为 87 79 91 85总数为 87 79 91 85 342一个大方格的平均数为 342 4 85 51ml液体中细胞量为 85 5 104如果用染液稀释后计数 则细胞数为该数据的2倍 效 靶细胞作用 将效应细胞和靶细胞各0 1ml E T 100 1 加入96孔细胞培养板的孔中 每份标本设2个复孔 同时设靶细胞自然释放对照组 0 1ml靶细胞 0 1mlRPMI 1640液 最大释放对照组 0 1ml靶细胞 0 1ml1 NP 40液 1000r min 2min后 置37 5 CO2温箱中孵育2 4h 操作方法 酶促反应 从37 温箱中取出培养物 吸取各孔上清0 1ml加于另一培养板孔中 酶促反应 置37 预温10min 加入新鲜配制的底物溶液0 1ml 37 避光反应10 15min 终止酶促反应 用毛细吸管滴一滴1mol L柠檬酸30 l 结果计算 用酶标检测仪在570nm波长下读取各孔OD值 并计算NK细胞活性 实验组OD值 自然释放对照组OD值 NK细胞活性 最大释放对照组OD值 自然释放对照组OD值 100 1 无论采用何种试验方法 靶细胞的质量是影响细胞标记率 自然释放率及实验稳定性的重要因素 一般要求靶细胞的自然释放率 10 2 分离PBMC时 应用毛细吸管尽可能吸取灰白层 切勿搅动各层 3 吸取细胞培养上清时 应尽可能不吸动沉淀的细胞 4 用此法测得NK活性的正常值范围在10 40 注意事项 实验报告 记录NK细胞杀伤实验的原理 方法 结果 T淋巴细胞检查 1 T细胞检查 1 T细胞花环形成试验 Erythrocyterosetteformationtest ERFT E花环形成试验 Erythrocyterosetteformationtest ERFT 目的要求 1 掌握T淋巴细胞E花环试验的原理 正常值 了解其方法和用途 2 熟悉光镜下E花环的形态和计数方法 实验原理 T细胞表面具有能与绵羊红细胞 SRBC 表面糖肽结合的受体 称为E受体 CD2 已证实E受体是人类T细胞所特有的表面标志 当T细胞与SRBC混合后 SRBC便粘附于T细胞表面 呈现花环状 通过花环形成检查T细胞的方法 称为E花环形成试验 根据花环形成的多少 可测知T细胞的数目 从而间接了解机体细胞免疫功能状态 判断疾病的预后 考核药物疗效等 实验方法 淋巴细胞与SRBC按一定比例 1 10 混合37 5分钟 4 20分钟取样涂片瑞氏染色 镜检 计数E花环数 算出总花环形成率 正常值为60 80 结果观察 高倍镜检查 淋巴细胞呈蓝色 SRBC呈红色围绕淋巴细胞形成花环 凡