PCR的原理与应用PPT课件

第二章PCR技术的原理及应用 故事发生在1983年的春夏之交 KaryB Mullis 1944 在Cetus公司工作期间 发明了PCR 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼 1983年春夏之交的一个晚上 他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物 而不是一个引物 去扩增模板DNA的想法 很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖 Mullis是其中之一 Mullis开车的时候 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶 面对面地合成着DNA Mullis的第一个PCR实验 1983年9月中旬 Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37 一直保温 结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带 于是他认识到有必要用加热来解链 每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应 依次循环 1983年12月 他终于看到了被同位素标记的PCR条带 第一种高温菌DNA聚合酶的分离 美国黄石国家公园 Thermusaquaticus TheThermusaquaticusDNApolymeraseTaqNotpermanentlydestroyedat94 COptimaltemperatureis72 C 耐高温DNA聚合酶的种类 TaqDNA聚合酶 Thermusaquaticus Cetus Roche TthDNA聚合酶 Thermusthermophilus Toyobo PfuDNA聚合酶 Pyrococcusfuriosus Stratagene DeepVentDNA聚合酶 Bio labs TflDNA聚合酶 Thermusflavus Promega TliDNA聚合酶 Thermococcuslitoralis Promega VentDNA聚合酶 Bio labs PwoDNA聚合酶 Pyrococcuswoesei Roche PfxDNA聚合酶 Thermococcuskodakaraensis Invitrogen DynazymeDNA聚合酶 Thermusbrockianus Finnazyme FDDNA聚合酶 Thermussterophilus 复旦大学 Tma Tne KOD PCR仪器的变迁 三个水浴锅 用手移动 Mullis等人当时用的 电加热块 自来水冷却 PE 1988 电加热块 内置循环液冷却 PE 1989 三个加热块 机械手 Stratagene 1994 半导体制冷和加热 MJ PE BioMetra Eppendrof 温度梯度 荧光检测 如Roche的Lightcycler 风加热Lab on chip式的PCR仪 所谓的芯片PCR 中国的状况1991年出现三个水浴锅 机械手的原始PCR仪 华美 复日等 现在以半导体 Peltier板 制冷式为主 杭州博日 上海天呈 厦门安普利等 PCR的发展史 1983年春 Mullis发展出PCR的概念 1983年9月 Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验 只用一个循环 1983年12月 用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的第一个PCR片断 1985年12月20日 Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文 方法中用了PCR技术 导致Mullis的文章到处被拒 1985年10月25日申请了PCR的专利 1987年7月28日批准 专利号4 683 202 这回Mullis是第一发明人 1986年5月 Mullis在冷泉港实验室做专题报告 全世界从此开始学习PCR的方法 1986年6月 Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶 TaqDNApolymerase 这是85年春天Mullis建议做的 1988年 第一台PCR仪问世 1991年 HoffmanLaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权 PCR不只是一个方法改进 Mullis的上司有句 名言 我们要扩增这么多DNA样品有什么用 到了1991 Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士HoffmanLaRoche公司 并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红 Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖 PCR和DNA重组技术一样意义深远 PCR相关的术语和产品层出不穷 T vectorHotStartTaqRT PCRRAPD PCRDDRT PCRLM PCRInversePCRNestedPCRReal timePCRRACEFlowchipPCR TASMultiplexPCRImmunoPCRAsymmetricPCRLP PCRNASBARecombinantPCRAFLPSSCPInsituPCRTaqMan SYBRgreen 1stcycle 2ndcycle 3rdcycle 过程 变性 引物退火 DNA复制 一 PCR的基本原理 二 PCR的种类1 普通PCR PCR 琼脂糖凝胶电泳 最终产物 紫外光观察 3 4小时 PCR具有极高的灵敏度 样品 正对照 负对照 标准分子量 污染是PCR实验的常见问题 只要实验室里曾经扩增过某个片段 就有可能以后的实验中发生污染 因此 做实验的时候绝对不要忘了负对照 用紫外灯破坏污染物也是一个办法 二 PCR的种类2 RT PCR 反转录PCR reversetranscriptase PCR 原理 RNA的反转录 RT 和cDNA的聚合酶链式扩增 PCR 相结合的技术 首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA 再以cDNA为模板 扩增合成目的片段 特点 作为模板的RNA可以是总RNA mRNA或体外转录的RNA产物 无论使用何种RNA 关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物 OligodT及基因特异性引物 GSP 中的一种 对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA 三种都可 应用 RT PCR技术灵敏而且用途广泛 分析基因的转录水平 细胞中RNA病毒的含量 直接克隆特定基因的cDNA序列 两步法RT PCR示意图 一步法RT PCR示意图 一步法和两步法RT PCR的比较 cDNA合成过程示意图 cDNA序列的克隆 二 PCR的种类2 NestedPCR 巢式PCR原理 利用两套PCR引物 巢式引物 对进行两轮PCR扩增反应 在第一轮扩增中 外引物用以产生扩增产物 此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增 优点 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增 从而降低了扩增多个靶位点的可能性 因为与两套引物都互补的引物很少 增加了检测的敏感性 两对PCR引物与检测模板的配对 增加了检测的可靠性 增加有限量靶序列 如稀有mRNA 的灵敏度 并且提高了困难PCR 如5 RACE 的特异性 应用 一般应用于动物方面 如 病毒 梅毒螺旋体 HIV 肿瘤基因等 NestedPCR原理示意图 二 PCR的种类3 InversePCR 反向PCR原理 用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA 以产生适合于PCR扩增大小的片段 然后片段的末端再连接形成环状分子 PCR的引物同源于环上核心区的末端序列 但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区 这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列 还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上 下游序列 优点 可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增 应用 一般应用于未知序列的扩增 有时也用于定点突变 InversePCR原理示意图 二 PCR的种类 4 PCR RFLP 多聚酶链反应 PCR 限制性片段长度多态性 restrictionfragmentlengthPolymorphism RFLP 原理 PCR产物 限制性内切酶切 多态性分析 DNA发生重排后 酶切位点发生改变 优点 具有分辩率高 无需标记 重复性好 简便快速直观等 主要用于核酸变异性分析与比较 微生物的分群分型分亚型 癌基因分析 遗传病的诊断等 局限 只能应用突变引起限制性酶切位点改变的情况下 一次只能完成一个特定位点突变筛选 检测效率低 PCR RFLP原理示意图 5 PCR SSCP 聚合酶链反应一单链构象多态性 singlestrandconformationpolymorphism 原理 是将经扩增的DNA片段经过变性处理 形成单链 由于序列不同 单链构象就有差异 在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同 通过与标准物的对比 即可检测出有无变异 特点 刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中 通过放射自显影显示结果 后用银染取代同位素显示DNA带型 大大降低了成本 具有经济 快速 灵敏等特点 1993年起用EB染色法显示DNA带型 优点 检测基因变异 具有操作简便 快速 不需特殊设备 适用于大样本筛选 己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变 基因的多态性分析等 一 PCR的种类 PCR SSCP示意图 从定性到定量的革命 聚合酶链式反应 PCR 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 在扩增反应结束之后 我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析 也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 无论定性还是定量分析 分析的都是PCR终产物 但是在许多情况下 我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量 例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量 在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生 普通PCR定量分析的困惑 PCR产物生成曲线 log DNA Cycles log DNA Cycles 不同样品有不同的生成曲线 实时定量PCR技术 是指在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程 使每一个循环变得 可见 最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA orcDNA 的起始浓度进行定量的方法 实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA 或cDNA 拷贝数最敏感 最准确的方法 RealTimePCRandConventionalPCR VS Repeat DenaturationPrimerAnnealingElongation 常规PCRProcess Intheory productaccumulationisproportionalto2n wherenisthenumberofamplificationcyclerepeats Realityvs Theory Amplificationisexponential buttheexponentialincreaseislimited AlinearincreasefollowsexponentialEventuallyplateaus 定量的最佳时期 Quantitativeinformationcomesfrommonitoringtheearlystagesofamplification RealLife Detector Theoretical LogTargetDNA Cycle 普通PCR和荧光定量PCR的区别 常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析 定量不准确 无法进行实时检测 荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程 使每一个循环变得 可见 通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA orcDNA 的起始浓度进行定量的方法 准确定量 普通PCR和定量PCR的区别 适用定性分析 不适合定量分析 PCR产物的长度从100bp 数kb 实时检测 每个循环都产出荧光信号绝对定量 灵敏度更高PCR产物的长度一般在60 150bps 荧光定量PCR的原理 基本原理 扩增呈指数增长 在反应体系和条件完全一致的情况下 样本DNA含量与扩增产物的对数成正比 由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物 荧光探针 与扩增产物结合发光 其荧光量与扩增产物量成正比 因此 通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量 荧光化合物分为两类 1 非特异性的嵌入荧光染料 利用嵌入荧光染料检测 只是简单地反映PCR反应体系中总的核酸量 是一种非特异性的检测方法 2 特异性荧光 引物 探针 增加了探针的识别步骤 特异性 专一性更高 非特异性的嵌入荧光染料 Non specificDNAbindingdyes SYBR GreenISYBR GoldEthidiumBromide Real TimePCR SYBRgreen MolecularProbe公司的一个专利产品 USPatent5 436 1341993年7月12日申请 SYBRgreen的优缺点 简便可以使用已有的引物普遍通用可以检测所有的双链DNA 包括引物二聚体 需要化大力气优化反应条件 以消除非特异性扩增 价格 1 PCR反应定量的灵敏度有所欠缺 Extension ExtensionContinuedApplyExcitationWavelength Repeat DNAbindingdyes 特异性的荧光探针 特异性的荧光探针是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针 通过探针与PCR产物特异性的结合 在PCR过程中可对产物实现均相 实时 定量检测 也适用于多通道检测 TaqMan探针 定量PCR TaqMan体系 ABI公司首先推出 PRISM7000系列 USPatent5 723 591 1995年11月申请 实时检测 每个循环都会产生与PCR产物成正比的荧光物质 TaqMan探针是一段5 端标记报告荧光基团 R 3 端标记淬灭荧光基团 Q 的寡核苷酸 其序列与模板DNA中的一段完全互补 当探针单独存在时 由于荧光共振能量转移的发生 R的荧光受到Q的猝灭 在PCR过程中 由于TaqDNA酶的5 3 外切酶活性的作用 使探针的5 端的R被切断 加大了与Q的距离而使荧光恢复 一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生 随着扩增循环数的增加 释放出来的荧光基团不断积累 因此 Taqman探针检测的是积累荧光 Cleavage basedassay TaqManTM d NTPs ThermalStableDNAPolymerase Primers AddMasterMixandSample Denaturation Annealing ReactionTube l 5 3 ExtensionStep 1 StrandDisplacement 2 Cleavage 3 PolymerizationComplete 4 Detection l Cleavage basedassay TaqManTM Cycle 一般而言 荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段 荧光背景信号阶段 荧光信号指数扩增阶段和平台期 在荧光背景信号阶段 扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖 我们无法判断产物量的变化 而在平台期 扩增产物已不再呈指数级的增加 PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系 所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数 只有在荧光信号指数扩增阶段 PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系 我们可以选择在这个阶段进行定量分析 为了定量和比较的方便 在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念 荧光阈值和CT值 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值 它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上 但一般我们将荧光域值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值 CtvalueandReal TimeQuantitativePCRTheory Ct值 ThresholdCycle PCR扩增过程中 扩增产物荧光信号超过基线值 进入指数增长期 时的循环数 principleofquantitativereal timePCR usewhenratherthanhowmuch fluorescentsignal PCRcycles real timePCRamplificationplots 7x10 folddilns NTC