2010CB945100-卵巢早衰的分子机制及其生物标记的研究.Doc

项目名称：卵巢早衰的分子机制及其生物标记的研究首席科学家：徐璎 南京大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：江苏省科技厅一、研究内容本项目组织了染色体分离阻断及卵泡形成、代谢衰老及神经内分泌与卵泡耗竭、生物节律与卵巢衰老3个基础研究团队和POF流行病学及临床诊疗研究团队，共四个课题组，对下列五个问题进行探讨：1）染色体分离异常导致卵泡储备不足的机制；2）代谢衰老及相关基因加速卵泡自主发育的机制；3）POF与时钟之间的分子机制的调控网络；4）神经内分泌与卵泡发育异常；5）卵巢早衰的易感基因筛选与临床干预。1. 染色体分离异常导致卵泡储备不足的机制卵细胞来源于原始生殖细胞。卵细胞的形成是一个漫长的过程，出生前原始生殖细胞先进行有丝分裂快速扩增，之后进入减数分裂并停滞在减数分裂I的前期。性成熟后，激素水平增高，刺激排卵，重新启动减数分裂过程并停滞在减数分裂II的中期，受精后减数分裂才得以完成。染色体的精确分离是保持基因组完整，从而形成健康的卵细胞的关键。姊妹染色体的异常分离造成基因组不稳定，产生异倍体等，从而引起卵细胞的缺陷，或卵泡形成数量的不足。此前，我们已经建立了几个染色体分离异常和调控染色体分离的有丝分裂检测点异常的基因工程小鼠，如Seperase和Securin基因敲除小鼠，并观察到生殖异常。在此基础上，我们将进行以下三个相互关联层面的研究：1.1 染色体分离相关基因与卵泡发育和卵巢早衰的相关机制1.1.1 进一步分析Seperase和Securin对卵细胞和颗粒细胞染色体分裂异常及其与生殖干细胞有丝分裂，卵细胞减数分裂异常相关的卵泡形成减少或卵泡耗竭过早的分子机制。此前，我们已经建立了相关基因敲除小鼠； 1.1.2 建立CDC20突变小鼠模型，研究染色体分离调控机制对卵泡发育和卵巢衰退的影响及其机制。此前，CDC20被发现与APC形成复合物，参与有丝分裂过程。在果蝇中CDC20蛋白家族成员还被发现为完成卵母细胞减数分裂所必需。因此，建立CDC20卵巢敲除小鼠，检验CDC20在卵泡发育和卵巢衰退中的作用十分必要。在以上两项研究中，特别注重对小鼠胚胎卵巢进行研究。1.2 时钟基因和寿命相关基因对卵细胞染色体分离的影响此前我们发现，Per2、CKle等时钟基因敲除小鼠表现出生殖缺陷。我们猜想，其它关键时钟基因如Per1、Reverb、Clock、Bmal1等也可能参与卵巢生殖功能。我们将利用我们实验室已有的Per1、Per2、Reverb、Clock、Bmal1和CKle等基因敲除小鼠模型，首先确定这些基因是否参与卵巢生殖。如果结果肯定，我们将研究这些时钟基因对卵细胞染色体分离过程的影响，及其在卵泡缺失和卵巢早衰中的作用。同理，我们将对影响寿命的p53进行相应的研究。1.3 已知染色体分离相关基因的临床筛查及新相关候选基因的小鼠模型验证1.3.1临床上验证引起生殖异常的已知染色体分离相关基因与卵泡缺失综合症和/或卵巢早衰的相关性；即在卵泡缺失综合症和卵巢早衰临床病人标本中寻找已知染色体分离相关基因与这些疾病的连锁性。1.3.2根据筛查出的新染色体分离相关基因，利用基因敲除和高表达小鼠模型，明确其在卵泡发生和卵巢早衰中的作用及其机制。2. 代谢衰老及相关基因加速卵泡耗竭的机制卵泡自主发育或迟滞的内在机制与代谢调控有着密切的关系。在生物进化中，当能量供应（食物）不足时，生物为了保存个体，以及为它的子代寻找合适的生存条件，往往推迟生殖细胞的成熟；而当能量供应丰富时，则加速生殖细胞的成熟。在实验小鼠中，限食可明显引起卵泡自主发育迟滞（Merry and Holehan 1979）。而在限食诱导的代谢相关基因FOXO3a卵巢敲除小鼠中，卵泡自主发育过激，卵泡提前耗竭（Castrillon, et al. 2003）；这一发现已在人体研究中得到证实。我们在前期工作中发现，代谢关键基因STAT3（Gao, et al. 2004; 2007）卵巢敲除小鼠存在严重的生殖障碍。事实上，STAT3在卵泡发育早期（始基和窦前卵泡）强烈表达，其后突然消失，提示STAT3可能在限制卵泡自主发育中起着关键作用。本课题将在确定限食对卵巢生殖功能及卵泡自主发育的影响的基础上，进行以下研究：2.1确定STAT3卵巢敲除对卵巢生殖功能及卵泡自主发育的影响STAT3作为代谢关键基因，参与体内糖、脂代谢平衡的核心过程（Gao, et al. 2004; 2007）。我们此前发现，STAT3卵巢敲除小鼠并表现出明显的生殖障碍。我们将延续此项研究，并对STAT3卵巢敲除引起的卵巢，特别是胚胎卵巢病理学变化，进行深入的研究，确定STAT3卵巢敲除对卵巢生殖功能及卵泡自主发育的影响；2.2 确定FOXO3a与STAT3在卵泡自主发育和耗竭过程中的相互拮抗作用代谢相关基因FOXO3a卵巢敲除导致卵泡自主发育过激，卵泡早耗（Castrillon, et al. 2003）；相反，FOXO3a在卵巢中高表达，则抑制卵泡自主发育（Liu, et al. 2007）。此前，我们及其他研究发现FOXO3a与STAT3在代谢平衡过程中，相互拮抗（Nie, et al. 2009）。我们将在本研究中，测试FOXO3a与STAT3在卵泡自主发育和耗竭过程中的相互（拮抗）作用机制，以期揭示STAT3卵巢敲除对卵巢生殖功能及卵泡自主发育的分子机制；2.3 确定p300、Sirt1对FOXO3a及STAT3的调控及其对卵泡自主发育的影响长寿蛋白Sirt1因应低能摄入，通过蛋白去乙酰化，调节FOXO3a和STAT3功能，是细胞营养感受信号通路的关键调控基因（Nie, et al. 2009）。P300则乙酰化FOXO3a及STAT3，对抗Sirt1功能。如果代谢果然调控卵泡自主激活与衰竭过程，Sirt1可能正是这一卵巢内在机制的开关。联系Sirt1与卵泡自主发育，将开启这一研究领域的新途径；一旦发现Sirt1参与卵泡自主发育的调控，可以尝试Sirt1的激动剂治疗卵巢早衰。2.4确定促性腺激素对卵巢FOXO3a及STAT3的表达及功能的调控作用最后，我们将研究生殖激素是否通过对卵巢FOXO3a及STAT3的表达及功能调控来实现其对卵泡自主发育的影响。3. 生物节律及机体衰老和卵巢功能衰退之间的相互影响及其机制现代生活方式和生存环境的激变直接影响正常生物节律，引起包括衰老及生殖障碍等。此前，我们发现时钟基因敲除小鼠，如Per2、CKle等敲除小鼠，表现出明显的生物节律紊乱和卵巢功能早衰。考虑到时钟基因敲除也引起一般衰老进程加速，研究衰老本身对生物节律及生殖障碍的影响，变得十分有意义。到目前为止，我们已经建立和收集了10多个生物钟紊乱遗传工程小鼠以及卵巢功能衰退模型。利用这些关键材料，我们将进一步研究：31.与课题一联合构建中国最大的卵巢早衰模式动物平台在本课题中主要建立与生物节律、神经内分泌和衰老密切相关加速卵巢早衰的模式动物。31.1 建立自主知识产权的小鼠模型此前，我们发现时钟基因敲除小鼠，如Per2、CKle等敲除小鼠，表现出明显的生物节律紊乱和卵巢功能早衰。我们已经建立和收集了10多个生物钟紊乱遗传工程小鼠，将进一步定义这些生物钟紊乱小鼠在卵巢早衰中的意义。同时我们最新发现的调节生物钟速度的位于X染色体的一个新基因MAGED1在生殖功能中也具有严重的生殖障碍。因此我们将通过分析已有的资料，系统性建立一批卵巢早衰的基因敲除小鼠。31.2 我们将利用模式动物所优势，结合国际基因敲除小鼠计划的进行，引进一批对卵巢早衰研究有价值的小鼠模型。32.筛选与卵巢早衰、机体衰老密切相关的基因32.1 我们将利用果蝇筛选同时具有生殖功能障碍又有生物钟紊乱，衰老表型的相关基因。32.2 我们将通过各种模式动物比对，分析影响卵巢发育的关键基因，建立模型验证。3.3 研究生物节律、神经内分泌对卵巢早衰影响的分子机制3.31 生物节律对卵巢早衰的分子机制研究严格的生物节律的建立涉及复杂的时钟基因间的转录调控。事实上，多个时钟基因本身正是转录因子。研究生物节律紊乱及时钟基因敲除对卵泡基因表达的影响，找出调控卵泡发育衰老过程的关键调控基因，是研究生物节律调控卵泡发育衰老分子机制的重要内容。而时钟基因可在程度和性质上引起不同的节律改变或紊乱，如缩短或延长节律周期，甚至引起节律紊乱或丧失。我们此前观察到时钟基因敲除，节律改变引起生殖障碍，卵巢早衰。在本实验中，我们将系统地考察其它关键时钟基因在卵巢中的表达，以及对卵巢生殖功能的调控。我们将使用时钟基因luciferase reporter小鼠，利用整体image系统，建立中枢生物钟与卵巢周围钟之间的网络连接。33.2神经内分泌对卵巢早衰影响的分子机制生物节律对神经内分泌节律的调控又是显而易见的。特别是它对促性腺激素和女性周期的调控，对女性生殖意义重大。长期的生活节律紊乱导致的神经内分泌紊乱，进而影响生殖功能的例子不在少数。如此，生物节律通过对神经内分泌节律的调控实现对卵泡自主发育及成熟闭锁的影响，又构成生物节律对卵巢生殖功能的另一个层次的调控。因此，我们将利用条件性敲除Bmal1小鼠（无节律小鼠）研究神经内分泌的改变，用它与卵巢特殊CRE交配，研究卵巢局部敲除与整体敲除神经内分泌对卵巢生殖功能的影响。34.建立长寿基因，卵巢功能状态与生物节律的关系34.1长寿、卵巢功能、生物节律候选相关基因SNP筛选生物节律紊乱可致寿命缩短，卵巢功能早衰。这种生物节律与寿命和卵巢的相关性，提示长寿老人中时钟基因的SNP，与卵巢早衰病人时钟基因的SNP可能很不相同。为了探索时钟基因对人类卵巢功能早衰的影响，我们将与本项目相关课题组协作，对卵巢功能早衰病人时钟基因的SNP与百岁老人时钟基因的SNP，进行对比研究，进一步有效这些SNP的生理功能。34.2 机制研究对于已经报道的有关这三者的基因的动物模型进行分析，研究其中关联点。我们将特别关注位于X染色体上与生物钟调控相关的FMR基因、Maged1对生殖和寿命的机制研究。4. 神经内分泌与卵泡发育异常神经内分泌功能失调是公认的造成卵泡机能失调，加速卵泡消耗，致使卵巢早衰的重要原因之一。卵泡在自主发育成熟的各个阶段，都受性激素的调节。激素释放紊乱或缺失，无疑将影响卵巢的正常功能。多种激素或其受体基因的变异与人类卵巢早衰相关。在动物实验中，FSHR敲除小鼠（杂合子）表现出典型的卵泡耗竭病理学改变，各期卵泡闭锁明显增加（Danilovich, et al. 2002）。AR敲除小鼠，也表现出与FSHR+/-小鼠相似的，典型的卵巢早衰症象和细胞病理学变化（Shiina, et al. 2006）。相反，胚胎期高雄激素则诱导多囊卵巢综合症，其卵巢细胞病理学改变，表现为发育各期卵泡增多，闭锁减少等，其特征与卵巢衰老相反。这些结果，从反面证明，胚胎期卵泡发育与闭锁是研究卵巢功能的关键时期。本课题将聚焦FSHR和AR信号系统对卵泡发育，特别是胚胎期卵泡发育的影响，以及它们间的可能的相互作用：4.1 POF与PCOS的对比研究病理学变化：宫内高雄诱导子代PCOS，而AR-/-则导致POF，提示AR信号系统从强到弱，对卵泡发育存在连续性作用，而PCOS与POF正处于该系统的两个极端。确定POF与PCOS间的病理学差异，对两者进行直接的对比研究，尚未见报道。4.2 胚胎期高雄激素（PCOS）对FSHR+/-小鼠卵巢早衰的拯救FSHR信号阻断和AR信号阻断，导致相似的卵巢细胞病理学改变，提示这两条激素信号系统可能作用于相同的机制。反过来，胚胎期高雄激素诱导相反的细胞学变化。我们于是质问，宫内高雄激素可否拯救FSHR+/-子代小鼠的卵巢早衰？本实验可帮助我们确定：1）FSHR和AR信号系统的相互补充、相互平行或相互作用关系；2）雄激素或类似途径在治疗卵巢早衰中的潜力。胚胎期高雄激素对AR-/-小鼠卵巢早衰的作用将作为阴性对照；4.3 高雄激素延缓卵巢早衰的临床防治研究与前途 如前所述，高雄激素诱导的PCOS症表现为卵泡发育增加与闭锁减少，与AR-/-引起的卵巢早衰相反。提示高雄激素可被用于延缓卵巢早衰。事实上，中效雄激素类药物脱氢表雄酮临床上用于卵巢储备严重不足的高龄女性（40岁），明显提高了试者的雌激素水平和成熟卵泡的数量和质量，提升了对FSH的反应性，减少了卵泡闭锁，延缓了卵巢衰老。我们将首先确定并选择低睾酮POF人群，进行相关雄激素干预临床研究及治疗；4.4 围生期神经内分泌与胎源性成年疾病围生期，特别是胚胎期（宫内）雄激素紊乱，除了对卵泡发育的直接影响外，还具有长效的表遗传作用（Skinner, et al. 2008）。例如，宫内高雄诱导的PCOS动物模型，是典型的宫内激素紊乱引起的胎源性成年疾病（fetal origins of adult disease）的例子。人类相关研究支持这一学说。例如，据芬兰1734-1888年间377对双胞胎研究显示，男女双胎中女性的生殖能力，子代存活力，婚育率都较两女双胎女性明显下降。而男女双胎中的男性生殖能力则不受影响。提示孕期宫内高雄环境可致女婴成年后生育能力下降（Lummaa, et al. 2007）。如此，胚胎期生殖激素紊乱的研究，具有特殊的意义。5. 卵巢早衰的易感基因筛选与临床干预5.1 卵巢早衰新易感基因筛选按标准程序收集临床卵巢早衰（POF）确诊病人（200份），POF患者人群中进行POF致病候选基因，如FMR1、DBX等筛查，特别是利用在动物实验中确定的卵巢早衰相关基因，如时钟基因，代谢及衰老相关基因，在人群中进行筛查，确定一批卵巢功能过早衰退的相关基因；b）在患者人群达到理想数量，进行全基因扫描，微阵列筛选，直接寻找新的人类致病基因；c）分析侯选基因在不同年龄正常和临床卵巢功能衰退患者中的表达水平，及其与临床卵巢功能过早衰退发生的相关性，为新基因的动物模型研究打下基础； 5.2 POF临床干预临床POF的病因主要有遗传和免疫（环境影响）等因素。两者是否共同作用导致或加重POF的发生，目前并不清楚。对群体性POF病人样本的免疫分析表明，POF除了有明显的遗传因素外，近半数病人存在血清抗核抗体(antinuclear antibodies,ANA)、抗卵巢组织抗体(antiovarian antibodies，AOAb)、抗甲状腺微粒体抗体(antithyroid microsomal antibodies，A-TG)、抗双链DNA抗体(ds-DNA)以及补体C3含量显著升高。表明免疫亢进是POF的重要病理变化。更重要的是，免疫相关POF构成可逆性POF的主要部分，是POF临床干预的主要对象。 5.3 孕妇雄激素、ABP常规检查及高雄激素孕妇女婴成年后生殖健康追踪研究围生期神经内分泌与胎源性成年疾病研究，已越来越引起各国重视。目前，临床上孕妇雄激素水平，并不在常规检验之中，导致其对胎儿的长远影响，无法跟踪。我们将在临床开展孕妇雄激素、ABP常规检查，为女婴成年后生殖健康追踪研究作准备。二、预期目标1. 极大地提升对卵巢发育和衰老的核心生物学问题的研究水平，以新的思路和研究途径实现基础研究的新突破，推动生殖医学的临床研究与诊治水平；2. 建立新的基因工程小鼠，临床卵巢功能异常患者组织样本库；筛选POF遗传易感的新基因的特异靶基因或相互作用分子，分析这些新基因与POF的发病机理；初步确定高雄激素（DHEA）延缓卵巢早衰的临床干预方案；3. 获得一批有自主产权的重要成果，培养一批卵巢生殖研究的一流人才。（二）五年预期目标1. 揭示染色体分离、代谢衰老、神经内分泌及生物节律在卵巢发育、衰老过程中的调控机制；2. 实行新的POF临床诊治措施，特别是雄激素在POF诊断及干预中的应用；3. 找到新的卵巢早衰的关键基因，探讨其作用机制；制备1020个左右新的卵巢早衰相关基因敲除或转基因工程小鼠模型；4. 在国际主流杂志（IF3）上发表论文40篇以上，并争取在Nature、Science、Cell系列上发表论文，申请专利10项左右；5. 造就一支高水平的科研队伍，培养博士研究生约40名，硕士研究生30-50名，博士后研究人员20名左右。三、研究方案（一）学术思想和技术途径1. 学术思想以卵巢发育和衰老生物学核心问题为研究对象，推动当前POF临床实践。利用基础研究成果为POF的临床诊治提供新靶点；以临床研究中提出的问题，拓宽基础研究思路。2. 技术途径以模式动物作为在体研究系统，进行学科交叉，实现基础到临床，临床到基础的转化与反转化研究。（二）创新点与特色1. 特别强调卵巢发育与衰老的细胞和发育生物学本质生殖干细胞增殖（卵巢发生），减数分裂的阻滞和恢复（成熟和衰老）等构成卵巢发育与衰老的核心过程，后者并区别于一般细胞，包括干细胞和体细胞的衰老过程；2. 关注卵巢发育与衰老生物学的关键期胚胎期早在胚胎5周始基卵泡既已形成，到胚胎20周，卵泡数目已达最高峰，提示卵巢发育已臻完成；此后转入卵泡衰减的不可逆过程，到新生女婴，卵泡数量已不到高峰期的三分之一。胚胎期卵巢发育与衰老因此是相关研究的关键期；3. 模式动物作为在体研究体系实现学科交叉创新以模式动物作为载体，可进行在体分子生物学，细胞病理学，胚胎学，卵巢发生和衰老生物学，遗传学，生理学等研究。有利学科交叉创新；4. 强调卵巢细胞病理学与分子机制对应性研究多个基因已被揭示与卵泡的发育或衰老有关。详尽的分子机制与巢卵细胞病理学对应性研究，将加速关于卵巢早衰临床分型、检测、诊治和分子遗传学等的研究和应用。一是找到特定分子与卵细胞生成发育或成熟衰退间的对应关系；二是将特定分子与特定卵细胞发育阶段（形态学）联系起来。5. 从基础到临床、从临床到基础的转化研究强调在完善的流行病学和临床