（医学PPT课件）肿瘤分子探查报告解读for CSCO-

肿瘤相关的多基因突变检测技术及应用 1 概要 癌症诊疗现状突变与肿瘤MiDTM技术原理MiDTM临床应用结果判断和干预 2 癌症诊疗现状 3 H1N1病毒曾经让我们十分恐慌 但有多少在我们周围出现 癌症更值得我们警惕 因为出现在我们的亲朋好友 单位同事 隔壁邻居中 癌症就在我们身边 癌症就在我们身边 4 2008年全球有1270万新发癌症病例 死亡人数达到760万 癌症死亡的人数比艾滋病 疟疾和结核病加起来还要多 癌症已成中国居民的第一死因 每年有260多万新发病例 有180万人死亡 癌症发病率和死亡率数十年来无明显变化 但某些癌症的发病年龄的年轻化趋势一直存在 癌症发病情况 5 谈癌色变 癌症的特点 发现晚 治愈难 易复发 死亡率高 治疗过程痛苦 目前中国的癌症患者一年内死亡率近30 5年以上生存率仅31 77 患癌 死刑 6 不乏这样的例子 体检未发现癌症 半年后却发现癌症已是中晚期 有人不禁怀疑体检的必要性 也有人每年做全身CT扫描试图早些发现 但收效甚微 生活中有太多成功者和名人突然被癌症击倒 著名影星李媛媛 傅彪 央视播音员罗京 知名企业家王均瑶 国家领导人黄菊等 影像学诊断对中晚期的 1 2cm以上 比杏仁大 肿瘤具有比较高的灵敏性 因资源 费用和便捷性等限制 影像学检查很难用于广大人群的筛查 血清蛋白标志物效果有限 仅对部分晚期肿瘤的诊断有比较明显效果 更重要的是其特异性不强 多数情况下 体检为何查不出癌 7 癌症的形成是一个漫长过程 可以早期干预 早期发现 早期治疗和治愈 2006年起WHO等国际机构已将原来作为不治之症的癌症重新定义为可以治疗 控制 甚至治愈的慢性病 因此 提高肿瘤治愈的关键在于早期发现 8 9 肿瘤检测需要解决的核心问题 转归和治愈 干预和治疗 二次治疗机会 肿瘤和突变 10 影像学诊断借助肿瘤的占位效应 发现肿瘤 肿瘤血清标志物 特异蛋白含量 仅与肿瘤患者状态有关 非肿瘤分泌 肿瘤分子诊断 依据肿瘤特异DNA RNA的鉴别 分子检测技术是癌症诊断的新一波 浪潮 11 肿瘤是突变 驱动突变 累积的结果 癌变的形成要经过8 10年 而这漫长的时间其实就是一个多基因突变并累积的过程 其中主要的突变属于驱动型突变 drivingmutation 12 13 正常细胞向癌细胞恶性转化过程 其中包括启动阶段 Initiatingstage 促进阶段 Promotingstage 和进展阶段 Progressingstage 启动阶段 表现为DNA损伤及突变 细胞表型 Phenotype 基本不变 形态学为癌前病变 促进阶段 显示细胞表型及基因型 Genotype 明显改变 形态学已属癌变的原位癌 进展阶段 可出现癌细胞的浸润及转移 1立方微米的病灶中仅含500 3000个癌细胞 1立方毫米的病灶中包含5万 30万个癌细胞 当病灶尺寸为1立方厘米时 已经包含了5亿 30亿个癌细胞 对于早期干预来说 这已经太晚了 14 15 2006年多国联合启动的国际癌症基因组计划 是人类基因组计划后的又一重大科学研究 揭示更多地与癌症相关的突变类型 获得50种肿瘤的特定突变谱型 探寻突变与肿瘤发生发展的机理 为癌症的研究和诊断批量增加新的重要的DNA标记 国际癌症基因组计划 癌症基因组计划进展 已完成5种肿瘤的全基因组测序 每个肿瘤 平均90个突变基因 有显著频率的突变 189个突变 显著高频率 平均每肿瘤11个突变 对超过400个乳腺癌 肺癌 卵巢癌和前列腺癌样品所做的一项大规模遗传分析 识别出了涉及1507个编码基因的2576个体突变 在这些突变中 77个被认为是显著的突变 说明它们可能具有致病作用 包括蛋白激酶 G蛋白耦合的受体和其他潜在治疗目标 16 人类癌症中多种不同突变的大规模分析 Nature 2010Aug12 466 7308 869 73 17 Nature 2010May27 465 7297 473 7 Themutationspectrumrevealedbypairedgenomesequencesfromalungcancerpatient 完整基因组测序已为包括肺癌在内的若干种癌症类型的突变谱提供了线索 最新测序技术意味着 现在有可能从全基因组范围内来观察突变差异 而且现在研究人员对肺癌已经做到了这一点 并对一种原发性肺部肿瘤 一种腺癌 来自一名男子 他15年来每天平均吸烟25支 和相邻正常组织的完整序列进行了比较 比较结果显示了超过5万个 点突变 其中530个得到确认 它们当中392个在编码区域 包括以前已知的变异 如KRAS 原致癌基因 突变和放大 这些数据表明 遗传上复杂的肿瘤可能包含很多部分冗余的突变 而且要识别复发性致癌 驱动突变 drivermutation 将需要对很多尚未测序的样本进行测序 识别癌症发生相关的 驱动突变 18 结肠癌的多步骤癌变示意图 癌症是一种DNA缺陷疾病 DNA缺陷会导致基因变异 有些由致癌物诱发 从而使某些细胞开始不受控制地分裂 然后在体内扩散 癌症并非单一疾病 每种癌症都包括大量由不同类型基因变异导致的不同亚种类别 高灵敏度的集成突变检测技术是筛查和诊断癌症的关键 19 20 血液循环DNA是一个无创性分子标志物 Circulatingnucleicacidsasapotentialsourceforcancerbiomarkers VlassovVV LaktionovPP RykovaEY CurrMolMed 2010Mar 10 2 142 65 Review 如何检测微量突变 肿瘤细胞与正常细胞不同 很易脱落 脱落的恶变细胞进入血液 被人体免疫细胞攻击杀死 在血液中酶的作用下成为DNA碎片 近年发现 肿瘤患者血清中核酸 cellfreeDNA cfDNA 浓度明显升高 较正常人高出10到100倍 因此循环核酸中突变的检测要远早于影像学等改变 早期肿瘤患者血清或血浆中就有较高的cfDNA 相比从血细胞中筛查个别肿瘤细胞 从血清或血浆更容易发现来自肿瘤的标志分子 通过血浆监控来自肿瘤突变的方式是一种的诊断新途径 21 MiDTM技术原理 22 MiDetectorTM MiDTM 是荧光定量PCR HRM 本公司优化的特色突变富集技术融合成的新型自主产权开放式平台技术 应用MiDTM技术 国际上首次实现非细胞体系中DNA微量突变和异常甲基化的高灵敏度检测 2 国内外首次MiDTM技术 实现非细胞体系 主要是血清 血浆 中超过20个基因158或更多突变或异常甲基化的集成式检测 3 MiDTM可以诊断介于 米粒 和 杏仁 之间大小早期肿瘤 甚至更早期的比米粒还小的癌前病变 我们创新的技术平台 23 如何让癌症真的成为可控制的慢性病 核心是早期发现 早期发现肿瘤 95 可获得痊愈 早期诊断是大幅降低全球死亡率最有效方式 24 重要参考依据 1 VickiWhitehall KaylaTran AartiUmapathy AMulticenterBlindedStudytoEvaluateKRASMutationTestingMethodologiesintheClinicalSetting JournalofMolecularDiagnostics Vol 11 No 6 November2009 2 OliverGeulen ChristianWeilke MichaelHoffmann TheLightCycler480real timePCRsystem aversatileplatformforgeneticvariationresearch NatureMethods5 29February2008 doi 10 1038 nmeth f 207 3 EraliM VoelkerdingKV WittwerCT 2008 Highresolutionmeltingapplicationsforclinicallaboratorymedicine ExpMolPathol85 50 58 25 MiDTM突变检测技术核心之一 qPCR HRM qPCR HRM技术是基于高效稳健的PCR上的高分辨熔解曲线分析技术 是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法 qPCR HRM不受突变碱基位点与类型局限 在PCR结束后直接运行高分辨熔解 即可完成对样品突变分析 本公司突变检测试剂盒特点是高灵敏度和高特异性 检测灵敏度可以达到1 0 1 既能检测已知突变 也能检测未知突变 qPCR HRM的突变检测已获国际多中心双盲实验验证 灵敏度和准确性堪比国际公认的DxS公司产品 见下述参考文献1 26 熔解曲线的分析 已有应用与创新应用 SYBRGreenI产物特异性 基因的高分辨率扫描 荧光标记探针的基因分型 27 28 High ResolutionMelting高分辨率熔解分析 MiDTM集成式突变检测是癌症早期或超早期诊断的有效手段 各个肿瘤有不同的突变基因及其位点 即使是同一种肿瘤 每个人的突变谱型也不完全相同 一次筛查25基因158个位点 29 MiDTM技术筛检血清中微量的肿瘤细胞产生的DNA碎片 集成式检测与肿瘤密切相关的158个基因位点 找出突变的基因位点 从而发现基因损伤和肿瘤的踪迹 国际上首次实现血清及血浆中集成式检测多基因位点突变 筛选国际上公认的与肿瘤相关性最大的20多个基因 158个位点 可做健康人群的肿瘤筛查 MiDTM技术检测血浆中肿瘤相关驱动突变 30 MiDTM技术的临床应用 31 32 33 抑癌基因P53 PTEN APC P16 Notch1 BRCA1 2原癌基因EGFR PI3KCA K ras N ras H ras beta catenin C kit HER 2 AKT1 JAK2 B raf IDH1 2 CDH1 PDGFRA FLT3 MEK1 BCL 10 THRa b 癌症相关基因分类 34 35 36 37 38 形态分期不能很好说明肿瘤的恶性程度临床诊断恶性肿瘤和良性病变的主要依赖病理诊断 凭借的是肉眼观察到的组织细胞形态 然而 临床发现病理诊断为良性的肿瘤 多达30 50 会在未来几年转变为恶性肿瘤 而50 以上终生都不会成为肿瘤 组织的突变筛查突变是目前唯一可以辅助病理诊断组织良 恶性的有效分子指标 以MiDTM技术筛查来鉴定特定组织是否包含癌症相关的驱动突变 在病理的细胞层面加上分子异常检测 更能准确把握组织是否恶性 癌前病变中高危亚型的鉴定实现有效干预的重要前提是准确判断癌前病变是否有分子改变 同一种肿瘤有不同的突变基因及其位点 每个人的突变谱型也大多不完全相同 因此一次筛查多个基因数百个位点才有真正的诊断价值 39 突变作为一种界定肿瘤的良 恶性分子指标 40 以突变为基础的分子谱型是对细胞病理的很好补充 MiDetectorTM技术可以筛查不同类型肿块的突变谱型 41 产品功能 通过应用MiD技术扫描手术组织中突变情况 定期动态定量检测个性化分子标志的血清或血浆等含量 可以作为术后病人的复发提供新的监控方式 产品特点功能 手术病人的复发监控特点 非侵入式 多分子标志物集成检查 42 BEAMing检测突变用于观察肿瘤复发 NatMed 2008Sep 14 9 985 90 CirculatingmutantDNAtoassesstumordynamics 43 Recurrence freesurvivalasdetectedbyctDNAandCEA NatMed 2008Sep 14 9 985 90 CirculatingmutantDNAtoassesstumordynamics a Thedifferenceinrecurrence freesurvivalinsubjectswithdetectableversusundetectablepost operativectDNAlevels P 0 006byMantel Coxlogranktest b Thedifferenceinrecurrence freesurvivalinsubjectswithdetectableversusundetectablepost operativeCEAlevels P 0 03byMantel Coxlog ranktest 美国科学家近日发现癌症复发的诊断新方法 在实体肿瘤治疗之后 采用重排终端个性化分析 PARE 法 可检测到患者循环血的DNA中最明显遗传改变 从而可以评估肿瘤的治疗效果以及早期发现复发情况 详细方法见图解 相关论文发表于 科学 转化医学 SciTranslMed2010 2 20 20ra14PARE检出重排水平 与临床肿瘤治疗的效果相关 在手术治疗或者放 化疗后 PARE检出的重排DNA水平会下降 若肿瘤完全被清除 则重排DNA会消失 若重排DNA水平在治疗后下降但随后上升 则表明肿瘤未完全被清除 突变可判断癌症治疗效果 早期诊断复发 44 检测结果和干预 45 突变是肿瘤特异的一类分子标记本项检测中的突变均是国际肿瘤学界公认的与肿瘤发生发展密切相关的突变 是目前肿瘤非常特异的一类分子标记 体细胞突变这些突变属于体细胞突变 也是身体里面极微少的细胞发生了恶性改变 不是通过遗传父母来的 不能够通过口腔或血细胞直接检测得到 准确率将会不断提高目前检测覆盖约12种常见肿瘤 随着科学界对肿瘤相关基因组的研究进展 会发现新的肿瘤相关基因位点 我们会及时加入检测中 因此检测位点可能会增多 覆盖肿瘤及人群率将会不断提高 46 与SNP完全不同 该类突变完全不同于市场上所谓 基因检测 的突变 那种突变属于单核苷酸多态性 SNP 属于来自父母的特异性遗传改变 取身体的任何 组织细胞就可检测出来 目前主要用于预测一个人未来健康状况 即疾病风险的预测 而癌症的发生除与遗传因素有关外 还受到生活环境生活方式及饮食习惯等诸多因素的影响 单纯基因检测评估的临床应用意义有限 肿瘤相关的驱动突变与肿瘤发生发展直接相关SNP更多的体现是一个人区别与大多数人的遗传变化 反应的是一生中患病可能性 目前根本没病 我们检测的都是与癌症相关的体细胞突变 且为比较明确的驱动突变 直接和肿瘤的发生和发展进程密切相关 一旦检测出来就直接表明现在已经有肿瘤等疾病踪迹 不同于基因芯片检测的SNP 47 本次检测没有直接发现与肿瘤相关的突变 预示肿瘤相关疾病近期存在的可能性较低 本次检测没有发现肿瘤相关的突变 仅代表目前一定时间内无肿瘤突变细胞存在 但并不完全说明患者以后就没有患肿瘤可能 为保持久的健康 定期的早期肿瘤筛查复检是必要的 推荐1 2年进行一次筛检 48 如果检查出来突变 说明机体肯定存在突变的恶性细胞 机体肯定不完全正常 通过影像学检查 一种获得明确的影像学观察到的肿瘤存在 一种尚无法获得明确的肿块 可能处于癌前病变状态或超早期癌症状态 导致后期影像检查目前尚无法证实 如是无明显肿块的类型 突变预示的可能是癌症前期 可以通过多种方式使疾病进展得到抑制或回归正常 专家必须给出相应的计划 比如改变生活习惯 戒除烟酒 吃抗氧化剂和中医针对性保健等 如有癌前突变 需定期检测突变含量变化 确定前期防癌方案是否有效 49 首次检出血清中含有突变 表明当时身体里面有恶性突变细胞存在 数年后 二次检测中没有再发现该类型突变 这个是一个让人惊喜的变化 说明血液中突变含量降低了 且降低到本检测方法灵敏度以下 如再次复检还没发现原来突变 同时也没发现有其它新突变 预示目前采取的干预措施非常有效 应长期坚持 如此 可以初步判断该突变是一种超早期发现的突变类型 在经过多重干预后 让突变细胞在没有形成瘤块之前得到遏制 可以让您保持长期健康状态 突变结果的解读 4 首次有突变 二次后无突变 50 分子靶向治疗治疗的靶标是异常分子 而不是肿瘤细胞 这点与细胞毒类的化疗药物不同 它们针对的是肿瘤细胞 通过治疗癌变过程中的分子事件 使癌症成为可以长期控制的慢性病是一个可行的方案 WaunKiHong教授基于 癌前病变与癌共有一些分子生物学特征 的事实 推断对肿瘤有效的靶向治疗可能也适用于癌前病变 从而实现肿瘤预防 即 从治疗到预防的逆向推演 具有科学合理性 WaunKiHong是M D Anderson肿瘤中心肿瘤内科主任及教授 也是美国癌症学会教授和总统医学顾问 突变检测结果解读 5 早期病变治疗或干预 51 我们的探索 战胜癌症的奥秘 超早期发现突变可以通过多重有效干预 让突变细胞在没有形成瘤块之前得到遏制 甚至彻底清除突变的恶性细胞 这些措施包括 1 回归健康生活方式 清楚周围致癌因素 2 应用免疫增强剂 提升免疫清除恶变细胞 3 使用免疫细胞治疗 全面清除恶变细胞 52 措施有效性 1 通过第一种方式 可以部分抑制恶变情况的进一步发展 为后续的治疗提供良好的基础 2 采取免疫增强剂等方式提升免疫功能 包括中医的免疫增强剂和多肽类蛋白增强剂 短期更有效的是各类多肽类免疫增强剂 原来也用于晚期癌症的辅助治疗 这类多肽免疫增强剂一般对晚期癌症的有效性很低 但对还没有形成瘤快的组织效果非常好 检查出突变的人半年复查多数转阴 甚至后来多次复查均没再次出现 3 对于难以用免疫增强剂彻底清除的恶变细胞的人 更佳的方法是使用自体回输体外培养的免疫细胞如LAK NK细胞方法 可以彻底干净消灭恶变细胞 53 措施 免疫增强剂 多肽类 免疫细胞治疗 NK LAK细胞治疗 验证 这些免疫增强方法目前更多的是应用在晚期肿瘤上面 但临床效果不是特别明显 由于早期发现突变且没有形成实体肿瘤 这时候增强免疫的细胞的能力可以有效识别杀死恶变细胞 目前 我们的临床应用例证中证实该类方法有效 增强机体免疫可能是早期突变的更有效干预措施 54 保健措施改变不良生活习惯和合理饮食脱离有害环境等抗氧化保健食品干预措施中医治疗 未病 方案采用临床慢性疾病方案 癌前病变 其它可选择的保健和干预措施 55 56 MiDTM的应用优势 MiDTM是目前国际上唯一能通过 滴血 检测痕量DNA突变等肿瘤标志物 实现 肿瘤体检 分子鉴定和复发监控 未病先知 人一般只有明显症状才去医院 但癌症往往无明显和特异症状 影像学和生化指标等手段仅对中晚期癌症诊断有较好效果 通过分子诊断更高灵敏度和特异性能达到早期发现 个体化医疗 靶向药物带动了药物靶标的检测 到达预测用药疗效的结果 分子鉴定 除病理这个金标准外 开展以突变为主的分子鉴定 确定疑似送检组织的良恶性程度 突变是目前国际上唯一可以对病理难以分清的组织有一定辅助诊断作用的指标 实时监控 影像学对肿瘤动态检测有明显的滞后效应 难以即时准确反应治疗效果和预后 MiDTM通过定时定量检测血清个性标志物含量变化 做到个体化的疗效判断 预后指导及复发监控 MiDTM肿瘤相关基因突变检测技术适宜人群 1 肿瘤高危人群 45岁以上 长期生活在大城市 工作压力大的职业 有肿瘤家族史或有遗传易感性的人群 因职业和环境原因长期接触有害化学物质或放射线 有慢性炎症或癌前病变人群 长期吸烟 饮酒者 过多摄入高脂肪食物导致肥胖者 2 疑是肿瘤患者 身体里发现可疑肿块或病理检查有不典型增生 癌前病变 从分子层面鉴定是否有基因突变 3 肿瘤患者治疗中或治疗后 跟踪检测血液中基因突变量的变化 评估疗效 4 康复期癌症患者 既往曾患癌症 经治疗后可定期做MiDTM检测 从分子层面监控是否再次出现原有的基因突变 能够较临床检查更早发现复发迹象 57 MiDTM肿瘤相关基因突变检测阳性意义 1 癌症潜伏期或癌前病变状态 检查出有基因突变 经临床进一步检查未发现肿块 说明机体存在突变的恶性细胞 预示的可能是癌症前期 或超早期癌症状态 需要采取早期干预措施 可以通过多种方式使疾病进展得到抑制或回归正常 如改变生活习惯 吃抗氧化剂和中医针对性保健 免疫治疗等 建议每半年复查一次 监测 对比突变量的变化 评估干预措施的有效性 2 癌症患者 如果检查出有基因突变 且突变量高 可通过影像学或内镜等临床检查寻找到肿块的位置 争取尽早治疗 3 癌症复发 曾患癌症的患者 如血液