重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达、鉴定.doc

重组人白细胞介素8在大肠杆菌的表达、鉴定【摘要】 目的：利用PCR技术1扩增hIL-8cDNA，将其与酶切后的原核表达载体pKpL3a（含PL启动子）质粒连接，并在大肠杆菌中进行表达、鉴定。方法：PCR技术扩增hIL-8cDNA获取目的基因，大肠杆菌质粒提取，将目的基因连接到大肠杆菌表达载体pKpL3a质粒中，重组DNA分子转化到Pop2136大肠杆菌中，利用其所产生的温度敏感性阻遏蛋白来调控外源基因表达，经ELISA反应检测其表达水平。结果：带hIL-8基因的重组pKpL3a质粒成功转化到Pop2136大肠杆菌中，经诱导，表达了IL-8并经ELISA反应检测了其表达水平。结论：hIL-8成功在大肠杆菌中表达。【关键词】hIL-8，PCR，重组DNA【Summary】 Purpose：Connecting the hIL-8 cDNA which is amplificated using PCR technology with the plasmid of prokaryotic expression vector digested pKpL3a (including PL promoter),and detecting the expression and identification of recombinant hIL-8 in E.coli。Method：Get target gene by amplificating hIL-8cDNA using PCR technology. Extract the E.coli plasmid. Connect the target gene with E.coli plasmid pKpL3a expression vector. Transform recombination DNA into E.coli Pop2136, and regulate gene expression of exogenous using the temperature-sensitive repressor protein, then detect the expression levels by ELISA reaction。Result：Recombinant plasmid PKpL3a with hIL-8 gene is successfully transformed into E.coli Pop2136 and expresses IL-8.The expression level of the IL-8 is detected by ELISA reaction.Conclusion：hIL-8 is successfully expressed in E. coli.【Keywords】hIL-8，PCR，Recombination DNA白细胞介素8（Interleukin-8）是一种具有趋化作用的细胞因子，对中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞具有区划作用，并可促进中性粒细胞的活化，在炎症反应中是一种重要的炎症因子。另外，IL-8还具有促进造血细胞增殖及新生血管生成作用，在伤口愈合和肿瘤生长及转移的过程中发挥重要作用。天然来源的IL-8含量极低，难以大批量制备，因而只能利用基因工程技术进行表达和生产2。本实验通过PCR获得IL-8的c-DNA，将其连接于原核表达载体pKpL3a（含PL启动子）中，用温度诱导表达技术使外源基因得以表达。1 材料与方法1.1 材料试剂 模板（cDNA文库，CLONTECH公司）；大肠杆菌（含pKpL-3a质粒）； 上游hIL-8 5引物（agtgctaaagaacttagatgt Tm=56，由Takara公司合成）；下游hIL-8 3引物（ccgtctagattatgaattataagccctct Tm=56，由Takara公司合成）； 酚-氯仿-异戊醇；NaAc；70乙醇，无水乙醇； 缓冲液A（50mM葡萄糖，10mM EDTA，25 mM Tris-HCl，pH8.0）；碱溶液；乙酸缓冲液；TE缓冲液；RNA酶A溶液； TAE电泳缓冲液；GEBS样本液；溴化乙锭； LA培养基；LA培养皿；100mM CaCl2； 包被抗体（抗IL-8单克隆抗体）；酶标抗体（酶标记IL-8单克隆抗体）；标准品（rHuIL-8，200ng/ml）；包被缓冲液（Ph9.6 0.05M CBS）；抗体稀释液（pH7.2 0.01M PBS）；洗涤液（pH7.2 0.15M PBS）；稀释液（pH7.2 0.15M PBS）；封闭液（牛血清白蛋白）；底物液（A液：TBM，B液：3H2O2）；终止液（2mol/L H2SO4） 工具酶TaqDNA聚合酶及其buffer：北联生物医学工程公司；dNTPmix：Takara公司；Klenow酶：北联生物医学工程公司，1U/l；内切酶Sty、Xba：Takara公司，20保存；T4DNA连接酶及其buffer：Takara公司1.2 仪器PCR仪，微量加样器（20l、200l、1000l），台式高速离心机，DYY-10型电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统，37孵箱，酶标仪，一次性酶标板1.3 实验方法 PCR技术扩增3hIL-8cDNA在0.2ml反应管中加入下列成份：ddH2O4l、10buffer5l、dNTP mix5l、模板2l、5引物2l、3引物2l、Taq酶10l，构建总量为20l的反应体系。在设定好的PCR仪上进行反应（95，3分钟；95，30秒；52，30秒；72摄氏度，30秒），反应35轮，72，6分钟。反应结束后取出8l进行琼脂糖凝胶电泳，向管中余下的12l反应体系中加入Klenow酶1l，室温30分钟，以修平扩增片段的3末端。转至1.5ml离心管中，加入50l酚-氯仿-异戊醇，混匀，离心10000rpm，30秒。吸取上层清液，转至另一已加入5l3MNaAc的1.5ml离心管中，加入150l无水乙醇，-20放置30min。离心10000rpm，5分钟，弃上清，加入0.5ml70%乙醇，10000rpm离心，5分钟，弃上清，空气中干燥，溶于20lTE。 质粒提取从转化平皿上接种一单菌落到LA培液体养基中，37震荡培养，待细菌浓度增至OD600=1.5时，收获细菌。取菌液1ml转至Eppendorf管中，离心8000rpm，2分钟，弃上清。加入200l缓冲液A，充分混悬细菌。加200l碱溶液，裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。加200l乙酸缓冲液，反复倒转管5次，混匀，冰浴10分钟。离心10000rpm，2分钟，上清转至另一Eppendorf管中。加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，-20放置1小时。离心10000rpm，5分钟，弃上清，加入70%乙醇0.5ml。勿混匀，离心10000rpm，5分钟，弃上清，干燥。加入50lTE，使质粒溶解，酶切备用。 限制性内切酶消化取两个Eppendorf管分别标记A、B后加入以下试剂，A管：ddH2O14l、10Mbuffer2l、0.1%BSA2l、PCR产物1l、Xba1l；B管：ddH2O16l、10Hbuffer2l、质粒DNA1l、Sty1l。37水浴45分钟。A管中加50l酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm离心2分钟，取上层液，转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积无水乙醇，1/10体积的乙酸钠，混匀，-20沉底30min，10000rpm离心5分钟，弃上清，500l70%乙醇洗一次，10000rpm离心2分钟，弃上清，干燥，加20lTE进一步用于连接反应。B管中加入1lKlenow酶、2ldNTPmix，室温放置30分钟。加50l酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm离心5分钟，取上层液，转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积无水乙醇，1/10体积的乙酸钠，混匀，-20沉底1小时， 10000rpm离心5分钟，弃上清，500l70%乙醇洗涤一次，干燥。将沉淀溶于15l水中，加入2l10Mbuffer、2l0.1%BSA、1lXba，37水浴30分钟。B管加50l酚-氯仿-异戊醇，混匀，10000rpm离心5min，取上层液，转至另一Eppendorf管中，加2.5倍体积的无水乙醇，1/10体积的乙酸钠，混匀，-20沉底30min，10000rpm离心5min，弃上清，500l70%乙醇洗涤一次，干燥，加20lTE，进一步用于连接反应。DNA琼脂糖凝胶电泳0.8%琼脂糖凝胶板的：取0.6g琼脂糖加80mlTAE（1），20ml水，微波炉加热融化3min，将其冷却至55-65，倒入制胶槽中。充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1），使其液面略高于琼脂糖板，拔出样品梳。DNA样品10l加5lGEBS样本液，在蜡面纸上混匀，全部加样于琼脂糖的样品孔中。稳压电泳80v约2小时，使溴酚蓝指示剂泳动到适当位置，1-5V/cm。取出凝胶板置溴化乙锭溶液中染色20分钟。在凝胶成像仪观察结果。 DNA连接4在Eppendorf管中加入下列物质进行连接反应：H2O9.5l、10T4DNA连接酶buffer2.5l、pKpL3DNA7l、IL-8PCR产物5l、T4DNA连接酶1l。置16水浴反应过夜。65水浴15分钟，灭活T4DNA连接酶，用于转化。 转化将无质粒大肠杆菌pop2136接种于1mlLB培养基，37培养3-5小时。待OD600=0.4时，转移至Eppendorf管中，离心8000rpm，2min，弃上清。加200l100mMCacl2，混匀，置冰浴30分钟。加10l连接好的质粒DNA，混匀，置冰浴30分钟。37水浴2分钟，冰浴2分钟。加入1mlLB培养基，37培养20min。取出100l涂于LA培养皿上，37倒置培养过夜。检查转化菌是否生成(只有转化的细菌才能在平皿上生长)。细胞因子的测定ELISA双抗体夹心法包被：将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100l/孔，放置湿盒中，4，过夜。封闭：洗板3次，加封闭液，200l/孔，放置湿盒中，3730min。待检样本：洗板3次，加入待测样品，阴性对照及倍比稀释的标准品，100l/孔，放置湿盒中，3730min。加酶标抗体：洗板3次，加入稀释好的酶标抗体，100l/孔，放置湿盒中，3730min。显色：洗板3次，加入显色液，A液一滴，B液一滴。室温或37显色5-10min。加终止液一滴。酶标仪测450nm处OD值，以OD值为横坐标，标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线。2结果2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳见图1 1组 2组 3组 4组图1DNA琼脂糖凝胶电泳图注：PCRProducts:228bp本小组为第1组，扩增结果显示一致的扩增区带，PCR产物与设计的228bp相符，并无非特异性扩增，说明目的基因扩增成功。2.2 转化结果见图2本小组为第1组，转化结果显示，LA培养基上培养出散在的透明菌落，说明目的基因hIL-8cDNA与质粒表达载体pKpL-3a的连接是成功的。2.3ELISA双抗体夹心法检测IL-8含量所测OD值和标准曲线见表1和图3 表1 450nm处OD值123456789101112AB0.1730.1080.1160.1040.0990.0990.1020.113标准品1C0.1410.1220.1580.1040.110.1020.0940.098标准品2D0.1280.1250.1210.083样品1E0.1490.1250.1190.152样品2F0.3950.394+对照G0.0820.094-对照H线性方程为y255.09x24.502样品组的4个浓度分别为： C1255.090.12824.5028.14952；C2255.090.12524.5027.38425；C3255.090.12124.5026.36389；C4255.090.08324.5023.32953(负值舍去)待测样品的浓度值为C（C1C22C34）/316.12ng/ml3 讨论3.1 设计的原理及意义 PCR5是一项DNA体外合成技术，类似于生物体内的DNA复制过程。是在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，由DNA聚合酶催化，按照半保留复制的原则合成两个子代DNA双链。反应过程为6变性：将反应体系升温至95左右，样品中双链DNA解开成两条单链，各自作为模板（待拷贝的 DNA 称为模板）；退火：将温度降至引物的Tm值以下(55左右)，5端和3端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合；延伸：将温度升到75左右，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种 dNTP，从引物3-OH端开始，依据模板碱基序列互补方式依次聚合，合成一条互补的DNA链7 8。 在含质粒的大肠杆菌混悬液中加SDS和NaOH，使菌体充分裂解，并使蛋白质和染色体DNA变性，加醋酸钾使变性蛋白、染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA存于上清中，异丙醇可使质粒DNA沉淀，即可用于内切酶消化。在某些情况下，需要用酚-氯仿-异戊醇去除残留的蛋白质。 限制性内切酶是一群从原核细胞提取的DNA酶，不同的内切酶能够特异性地识别不同的核苷酸序列，并在一定部位切割双链DNA的磷酸二酯键，内切酶是基因组中重要的工具酶。 琼脂糖是一种从海藻中提取的长链状糖类多聚物,为白色的小颗粒或粉末状。在水中加热到90-100，3-5分钟融化成清亮的液态,缓慢降温至 45 ，即可形成内部有孔隙半固体状凝胶。可以根据需要配制一定的浓度。DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。而琼脂糖凝胶具有分子筛作用，不同分子量或分子形状的核酸，其移动速度有差异。因此，利用这种“电荷”和“分子筛”的双重效应，达到分离核酸的目的。 T4 噬菌体DNA 连接酶(T4 DNA 连接酶)最早从T4噬菌体感染的大肠埃希菌中发现并分离出来，能催化一个DNA片段的3-OH与另一个DNA片段的5-P之间形成磷酸二酯键，其底物可以是两个双链DNA分子的互补黏性末端或平末端，基因工程中常用。在本实验中，将表达载体pKpL-3a DNA Sty切，Klenow补齐，Xba切和IL-8 cDNA的PCR产物用Xba切割后，重新用T4连接酶连接，可将人IL-8 cDNA片段插入pKpL-3a质粒中构建成表达人重组IL-8的质粒克隆。 体外构建的重组DNA分子需要导入合适的受体细胞才能进行复制扩增或表达。不同的重组DNA分子需要在适当的受体细胞中扩增、表达，因此应选择不同的导入方法。转化是指将质粒载体的重组DNA分子导入细菌（原核细胞）的过程。感受态细胞氯化钙转化法：感受态细胞是指处于能摄入外源 DNA的这种生理状态的细胞。用低渗氯化钙溶液在0-4 条件下处理快速生长期的细菌，使细菌细胞壁和膜的通透性增加，处于感受态；然后加入重组DNA或质粒DNA,通过42 热激4590s，促使DNA分子进入细胞内。由于不同的细菌带有不同的抗生素抵抗基因（本实验质粒均带有氨苄青霉素抵抗基因），根据转化菌的耐药特性，可将其与非转化菌区别。 在含有噬菌体调控序列（如PL启动子）的原核表达载体表达外源基因时，可通过温度诱导表达技术控制外源基因的表达。本实验选用温度诱导表达技术表达人IL-8,在原核表达载体pKpL-3a上带有PL启动子，大肠杆菌pop2136带有C1857基因，编码温度敏感性。阻遏蛋白。30培养时，阻遏蛋白保持活性，抑制PL启动子的转录，外源基因不能表达，细菌得以正常生长；在细菌充分扩增后，42培养，使阻遏蛋白失活，PL启动子失去抑制，外源基因得以表达。 采用两株识别不同表位的IL-8单克隆抗体，其中一株作为包被抗体，以识别和结合待检测标本中的IL-8，另一株作为酶标抗体，与结合于包被抗体的IL-8的另一表位结合，并催化底物显色，根据标准品OD值绘制标准曲线，从而计算出待检标本中IL-8的含量。ELISA实验中常用的酶为辣根过氧化物酶，显色方法为联苯胺法，联苯胺如DAB和四甲基联苯胺TMB能被过氧化物酶分解过氧化氢所产生的氧所氧化，形成有色多聚体沉淀，其中DAB被氧化为棕褐色沉淀，TMB被氧化为深蓝色沉淀。3.2 阳性/阴性结果的意义及其原因 mRNA的合成分为以下阶段，转录起始复合物在启动子部位形成RNA链随着转录泡的移动得以延长DNA模板终止信号控制使转录停止初级转录物加工后成熟；蛋白质的合成分为以下阶段，起始形成翻译起始复合物加氨基酸经过进位、成肽和转位进行延长终止密码子导致合成停止。这意味着，基因指导蛋白质的合成是一个复杂有序的过程。基因的特殊结构在这一过程中起到重要作用。人编码IL-8的基因序列包含有启动子、调控序列、关键序列以及终止子，其中关键序列是真正编码IL-8的基因序列，共219bp，在PCR扩增进行引物设计时，关键序列是决定引物设计的重要部分。引物的设计原则是引物长度要合适，一般为1630个核苷酸，常用20bp左右；引物的碱基组成和特异性，G+C含量一般占4060，有利于引物与模板的结合；引物内部不能存在互补序列，以避免形成发夹结构；引物3末端碱基一定要与模板正确配对，引物3端最佳碱基选择是G和C；引物的5端可以修饰，如：引入酶切位点、启动子序列、用荧光素、生物素等标记等。本实验在3断引物的5断加入了Xba酶切位点以及保护性碱基，共9bp，与目的基因关键序列的219bp共228bp，这也是琼脂糖凝胶电泳检测扩增的IL-8DNA产物条带在228bp处的原因。 体外构建的重组DNA分子需要导入合适的受体细胞才能进行复制扩增或表达。不同的重组DNA分子需要在适当的受体细胞中扩增、表达，因此应选择不同的导入方法。转化重组DNA向细菌细胞转入 ，有感受态细胞氯化钙转化法和电击转化法(高压电穿孔法)；转染是指将噬菌体载体或病毒载体的重组DNA分子引入真核细胞的过程，有磷酸钙沉淀法(DNA/磷酸钙共沉淀法)、二乙氨乙基DEAE-葡聚糖法、电穿孔转染法、显微注射法和脂质体介导法；感染是指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体颗粒或病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA注入细菌或真核细胞，是目的基因得以复制繁殖的过程。本实验采用转化的方法，将重组DNA分子转入到原核大肠杆菌中，进行筛选鉴定，大肠杆菌治质粒带有抗氨苄青霉素的基因，当带有完整耐药性基因的载体转化无耐药性细胞后，转入载体的细胞获得耐药性，能在含相应抗生素的培养板上生长成菌落，而未被转化的细胞不能生长。本实验经LA培养基培养转入重组DNA的大肠杆菌后，结果显示有散在的透明菌落，说明有含有抗氨苄青霉素基因的细菌生长，从而可以根据重组载体的遗传表型进行重组DNA的筛选 。 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原），再加相应酶标记抗体（抗原），生成抗原（抗体）-待测抗体（抗原）-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。本实验标准品的OD值与阳性对照相比偏小，而且数值整体不理想，经分析，可能为如下原因： 1）标本因素：血清或血浆中残留的凝块或红细胞须离心去除，勿用溶血或脂肪过多的血清，细菌的污染等因素会干扰实验，导致实验结果的错误。2）试剂因素：过期或被污染的实验试剂导致实验结果的失败。3）操作因素：加样时所加物没有加在ELISA板孔底部，加在了孔壁上部，并且有部分溅出；加样时所加物置于ELISA板孔边缘位置，反应温度不平衡，且公司的试剂