《基因工程讲稿》PPT课件

基因工程转基因生物 一 基因工程概述二 基因工程的主要工作三 基因工程中常用的技术四 基因工程技术在医学领域中的应用 geneticengineering 基因工程 一 基因工程概述概念 定向改造细胞或生物个体的特性所用的方法及相关的工作 1 可在亲缘关系极远的生物之间进行 能大幅度地改变生物遗传特性2 能定向地改变生物遗传特性3 能快速和稳定地获得新品种 基因工程的优越性 二 基因工程的主要工作 一 工具酶 二 载体 三 主要工作 一 工具酶限制酶修饰酶 类型 1 限制酶 restrictionenzyme 全称 限制性内切核酸酶识别双链DNA内部特异部位裂解磷酸二酯键来源 原核生物细胞中分离 功能 限制酶特点 具有识别专一性和特异性 4 6个bp 如 EcoR 5 GAATTC 3 BamH 5 GGATCC 3 Hind 5 AAGCTT 3 具有特定的酶切位点交错切割平整切割 只识别核苷酸序列 不管DNA的来源 切割方式 平整切割 切口平齐 如Sma 5 CCC GGG3 CCC5 3 GGG 交错切割 切口错位 如EcoR 5 GAATTC3 3 CTTAAG5 5 GAATTC3 3 CTTAAG5 2 修饰酶DNA聚合酶TaqDNA聚合酶逆转录酶耐热DNA聚合酶T4DNA连接酶RNA聚合酶碱性磷酸酶核酸酶 DNA聚合酶方向 5 3 合成DNA链 逆转录酶以RNA为模板 合成DNA T4DNA连接酶催化DNA链间的连接 二 载体载体 能运载目的基因进入宿主细胞并进行增殖的DNA称为载体 1 质粒 plasmid 独立于细菌染色体以外的一种遗传物质 为环状闭合双链DNA 通常可接受10Kb以下的外源基因 能独立地进行复制 中 随细菌染色体一同复制 常用的载体 能自由地进入细菌 可以整合到细菌染色体 2 噬菌体 bacteriophage phage 细菌病毒 为环状双链DNA 通常可接受20Kb以上的外源基因 作为载体应满足的条件1 分子量相对较小 能在细菌体内稳定存在 有较高的拷贝数2 具有多个限制酶的单一酶切位点3 具有一个以上的便于选择的遗传标志4 载体上插入外源DNA后 不影响其自身的复制能力且对宿主细胞无毒害5 最好含有启动子 控制并促进外源DNA表达 三 主要工作1 获得特定的基因片断2 基因片断与运载体结合3 将重组DNA分子引入宿主细胞4 扩增5 筛选6 检测 三 基因工程中常用的技术 一 核酸分子杂交技术 二 核酸分子的体外扩增 核酸分子杂交 nucleicacidhybridization 是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程 杂交的双方分别称为探针 probe 与待测核酸 待测核酸 探针 一 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交的基本原理 基本原理 碱基互补原则 DNA的变性与复性变性导致DNA两条链之间的氢键断裂 而核酸分子中的所有共价键不受影响 称为DNA变性 复性去除DNA变性因素 两条DNA链重新结合成DNA双螺旋结构 称为DNA复性 核酸分子杂交的基本方法 Southern印迹杂交 Southernblot 检测细胞中的外源DNA分子 待测核酸样品的制备 待测DNA样品的电泳分离 凝胶中核酸的变性 转膜 探针制备 杂交 洗膜8 杂交结果的检测 步骤 目的 酶切 Southern杂交法 杂交 制备探针 二 核酸的体外扩增 polymerasechainreaction PCR 聚合酶链反应技术 1 目的在体外快速精确扩增基因组DNA2 原理碱基互补原则 DNA复制3 优点 反应体系相对简单 准确性高 时间短 4 基本过程通过改变温度引起的重复进行DNA复制的过程 变性 95 C左右 退火 引物Tm值 延伸 70 C左右循环30次左右 DNA分子数扩增至2n倍 拷贝数约108 109个分子 5 反应体系 50 100 体积 模板DNA 102 105拷贝 引物 DNA dNTPs缓冲液 Tris Cl和KCl dH2OTaqDNA聚合酶 耐热酶 MgCl2 四 基因工程技术在医学领域中的应用遗传病病因的研究疾病的诊断生物制品和制药工业中的应用基因治疗 1 遗传病病因的研究镰型细胞贫血症血红素珠蛋白 血红蛋白 红细胞 链 链 正常人 Hb 患者 Hbs DNA Pr mRNA GAG GAG 缬氨酸 谷氨酸 GTG GUG 镰型细胞贫血症严重的贫血红细胞在静脉中变形1949年血红蛋白在电泳中慢速1956年血红蛋白珠蛋白 链第6位谷氨酸证实DNA分子GAG 缬氨酸 GTG 2 疾病的诊断基因诊断 genediagnosis 以DNA和RNA为诊断材料 通过检查基因的存在 缺陷或表达异常 对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程 基本原理检测DNA RNA的结构检测DNA RNA的含量检测DNA的表达功能 Pr RNA 基因诊断的临床意义对疾病早期 确切诊断确立个体对疾病的易感性确立疾病的分期分型疗效监测预后判断等 基因诊断原理和方法的应用遗传性疾病感染性疾病肿瘤法医学 感染性疾病的诊断细菌 细菌性痢疾 病毒 病毒性肝炎 寄生虫 疟原虫 方法 1 PCR法扩增病原体DNA2 杂交 病原体 肿瘤的基因诊断方法 1 检测肿瘤相关基因2 检测肿瘤相关病毒的基因3 检测肿瘤标识物基因或DNA 方法 1 检测肿瘤相关基因抑癌基因p53基因约50 以上癌症癌基因ras基因90 胰腺癌50 结直肠癌约1 3肺腺癌2 检测肿瘤相关病毒的基因鼻咽癌EB病毒肝癌HBE病毒HCV病毒宫颈癌HPV病毒3 检测肿瘤标识物基因或DNA约50 以上癌症有p53基因突变突变p53基因作为某些肿瘤的基因标志 基因诊断在法医学中的应用主要目的 应用DNA指纹技术进行个人识别和亲子鉴定 DNA指纹Southern杂交 得到大小不等的杂交带 且杂交带数目和分子量大小具有个体特异性 就像人的指纹一样 称杂交带图谱为DNA指纹 AGGTCAGGTCAGGTCAGGTC CTA GCT 生物制品和制药工业中的应用抗菌素干扰素生长激素胰岛素生长激素释放抑制因子乙肝疫苗SARS疫苗基因治疗策略 用重组DNA技术将正常基因插入患者基因组使其表达 产生正常基因产物 达到治疗目的 方法 体细胞基因治疗 目前研究方向生殖细胞基因治疗 将正常基因转入受精卵细胞或2 8细胞期 转基因生物 转基因生物转基因动物 transgenicanimal 转基因植物 transgenicplant 指用人工的方法将外源基因导入并整合到基因组内 并能稳定传代的一类动物或植物 外源基因 某生物基因组DNA 基本概念 由于转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离 使基因能在种系关系很远的机体间流动 它将对整个生命科学产生全局性影响 因此转基因动物技术在1991年第一次国际基因定位会议上被公认是遗传学中继连锁分析 体细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术 被列为生物学发展史上126年中第14个转折点 转基因动物技术特点 分子细胞水平操作组织及动物整体水平表达转基因动物的意义 1 从完整的系统中去认识生物大分子的作用2 从整体水平了解基因的作用 1981年美国Brinster和Palmiter著名的转基因超级小鼠或巨鼠 将外源基因用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中 使外源基因整合到实验动物的受精卵细胞的基因组中 然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体