硕士论文答辩 (2)ppt课件

曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系的建立 研究生导师学院 Theestablishmentofreal timefluorescentquantitativePCRassaysforthedetectionofAspergillus 2 1 研究背景2 研究目的3 实验路线4 第一部分曲霉菌标准株的培养与DNA提取5 第二部分曲霉菌FQ PCR检测体系的建立及评价6 结果与讨论7 全文结论 目录 3 研究背景 4 研究背景 曲霉菌属 aspergillus 属丝状真菌 是一种常见的条件致病性真菌 好发于免疫低下及缺陷的人群在免疫缺陷 恶性肿瘤 器官移植患者中的感染率呈上升趋势 YuY AmJperinatol 2013MelladoE RevlberoamMicol 2013Armstrong JamesD Trendsinmicrobiology 2014KauffmanCA Fungalinfections 2013 研究背景 地方性真菌1 地方性真菌3 5 1990年 1999年 2000年 2008年 leukemiapatients M D AndersonCancercenter CID 2010 50 405 15杨尚伦 急性淋巴细胞白血病真菌感染临床特点分析 J 实用癌症志 2014 9 1182 1184 2008年 2013年 6 研究背景 侵袭性曲霉菌病 InvasiveAspergillosis IA 是感染曲霉菌所引起的一种慢性霉菌病最常见的致病性曲霉菌 烟曲霉菌 黄曲霉菌土曲霉菌 黑曲霉菌 ArvanitisM ClinicalInfectiousDiseases 2015Kwon ChungKJ PLoSPathog 2013 7 研究背景 曲霉菌辅助检查方法 直接涂片和培养阳性率低 取材有创 困难 真菌感染诊断的研究热点 缺乏特异性 特征性表现出现晚 灵敏性 特异性高 但易受影响 出现假阳性及假阴性 FQ PCR技术在病毒感染的诊断检查技术方面已经成熟目前没有标准的用于临床的曲霉菌FQ PCR检测试剂盒 CFDA检索 前期已成功建立了念珠菌及新型隐球菌实时荧光定量PCR检测体系 8 研究背景 LauAMethodsMolBiol 2013AittakorpiA Journalofclinicalmicrobiology 2012 建立曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系 关键在于曲霉菌DNA的提取和特异性引物探针的设计 研究背景 10 研究背景 曲霉菌DNA提取方法 史俊艳 临床常见曲霉菌体外药物敏感性及分子生物学鉴定方法研究 D 中国协和医科大学 2010 Klimek OchabM FoliaMicrobiologica 2011 11 研究背景 曲霉菌DNA提取方法的选取 物理方法 液氮研磨法 次之 已有商品化试剂盒 玻璃珠机研磨法 最佳 但耗时长 超声波降解法 化学方法 CTAB缓冲液加微波法 酶消化法 快速有效 高渗震扰法 Klimek OchabM FoliaMicrobiologica 2011RittenourWR JournalofEnvironmentalMonitoring 2012O ConnorL US20110311969 P 2011 研究背景 GadeL EukaryotCell 2013OgawaM GraefesArchClinExpOphthalmol 2012RobinsonSL Mycologia 2012YuquanX Applied EnvironmentalMicrobiology 2013 扩增靶序列的选取 1 探针不保守2 引物Tm值不达要求 13 初步设计合成的四种曲霉菌引物探针序列 每种2套 研究背景 14 研究目的 课题来源 湖南省科技厅科技计划项目 2013FJ6028 儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCR检测研究 湖南省科技厅科技计划项目 2013FJ6028 儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCR检测研究 湖南省科技厅科技计划项目 2013FJ6028 儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCR检测研究 湖南省科技厅科技计划项目 2013FJ6028 儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCR检测研究 16 实验线路 曲霉菌标准株的接种及培养 制备提取DNA的标本 200mg左右的固体组织 105个孢子 ml的混悬液 液氮研磨法 一步结合加热法 下载曲霉菌特异性序列 设计引物探针并Blast对比 筛选引物探针 建立的荧光定量PCR检测体系 并进行重复性 特异性 灵敏性评估 1 分光光度计进行比较2 荧光定量PCR进行比较 引物探针送上海合成 18 第一部分曲霉菌标准株的培养与DNA提取方法的比较 19 材料与方法 实验材料 实验菌株真菌标准株 烟曲霉 CGMCC3 5305 黄曲霉 CGMCC3 5306 土曲霉 CGMCC3 4341 黑曲霉 CGMCC3 4335 购买于中国通微生物菌种保藏管理中心主要试剂一步法结合加热法DNA提取试剂盒 湖南圣湘生物有限公司E Z N A TMFungalDNAMiniKit 真菌DNA提取试剂盒 OMEGA公司 20 实验方法 1 SDA培养基培养曲霉菌2 制备DNA提取标本及提取DNA3 分光光度计检测两种方法的DNA浓度及OD值4 荧光定量PCR比较两种方法 观察曲线5 利用SPSS19 0统计软件分析不同方法提取DNA扩增的效果 21 22 实验结果与讨论 23 不同曲霉菌在SDA培养基上生长形态 烟曲霉菌 黄曲霉菌 土曲霉菌 黑曲霉菌 结果与讨论 1 曲霉菌的培养 24 不同曲霉菌光镜下菌落形态 烟曲霉菌 X100 黄曲霉菌 X100 土曲霉菌 X100 黑曲霉菌 X40 结果与讨论 1 曲霉菌的培养 25 肉眼观察SDA培养基上四种的菌落形态及颜色 结果与讨论 1 曲霉菌的培养 26 结果与讨论 1 曲霉菌的培养 曲霉菌培养的污染问题 因空气中广泛存在各种霉菌孢子 接种时若培养基长期暴露在空气中 则容易被污染同时高浓度培养的标准株若孢子纷飞可对实验室造成灾难性的损害 所以曲霉菌的接种及标本的制备必须在至少2级生物安全柜中进行 于接种前紫外灯照射半小时 接种后至少照射2小时 27 表 分光光度计测量液氮研磨法提取的DNA纯度和OD值 注 一步结合加热法提取的DNA量少 低于分光光度计检测的下限 未能检测出OD值 但两者样本的基础组织量不同 不具有可比性 结果与讨论 2 DNA提取方法的比较 28 结果与讨论 2 DNA提取方法的比较 液氮研磨法与一步结合加热法提取DNA行实时荧光定量PCR的比较 液氮研磨法 一步结合加热法 扩增曲线均为 S 型 29 结果与讨论 2 DNA提取方法的比较 两种DNA提取方法Ct值的比较 P 0 05 差异无统计学意义 即两种方法提取DNA进行荧光定量PCR检测无明显统计学差异 30 两种DNA提取方法的对比 结果与讨论 DNA提取方法的比较 31 第二部分曲霉菌FQ PCR检测体系的建立及评价 32 材料与方法 33 实验菌株实验用真菌标准株 多种曲霉菌购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心湖南省微生物室提供多种细菌 湖南圣湘生物有限提供乙肝病毒 支原体 衣原体 巨细胞病毒 结核菌 EB病毒 主要试剂Taq酶 Tris HClEDTA Buffer dNTP 0 1mol L MgCl2 1mol L PCR引物和探针 实验材料 34 实验方法 1 设计引物探针2 筛选引物探针3 PCR扩增产物送检测序4 培养其他曲霉菌及收集实验室标本评估体系特异性5 检测体系重复性 采用三种不同浓度的标本 批内 每一浓度同一天重复点样20次 批间 每一浓度连续5天重复点样20次 计算Ct值变异系数 CV 若CV 5 重复性好6 灵敏性检测 取102个孢子 ml标准菌株悬浮液按1 1 1 2 1 3的比例稀释进行FQ PCR 35 实时荧光定量扩增条件 94 C预变性5min后进入循环 94 C15s 57 C30s 共45个循环 在每个循环末收集荧光信号 实时荧光定量PCR反应体系 50ul 实验方法 36 实验结果与讨论 37 液氮研磨法提取的DNA为底物 四种曲霉菌不同引物 探针行实时荧光定量PCR扩增曲线 A fumigatus引物探针1 A fumigatus引物探针2 A flavus引物探针1 A flavus引物探针2 结果与讨论 1 引物探针的筛选 38 液氮研磨法提取的DNA为底物 四种曲霉菌不同引物 探针行实时荧光定量PCR扩增曲线 A terreus引物探针1 A terreus引物探针2 A niger引物探针1 A niger引物探针2 结果与讨论 1 引物探针的筛选 结果与讨论 1 引物探针的筛选 四种曲霉菌筛选完成的引物探针序列 40 结果与讨论 2 扩增产物测序 普通PCR扩增产物进行电泳分析 四种曲霉菌DNA的特异性序列扩增产物电泳条带清晰 亮度高 无拖带 涂抹带现象 扩增产物长度均约为100bp左右 扩增产物完整性好 41 结果与讨论 2 扩增产物测序 PCR扩增产物送至上海公司测序Blast结果 42 结果与讨论 3 特异性检测 四种曲霉菌FQ PCR特异性检测 其他曲霉菌 真菌及细菌 人类基因均未见扩增曲线 引物探针特异性好 与其他真菌 细菌 人类基因无交叉反应 结果与讨论 4 重复性实验 四种曲霉菌批内重复性试验 A fumigatus A flavus A terreus A niger 结果与讨论 4 重复性实验 批内重复性试验Ct均值与标准差 结果与讨论 4 重复性实验 批间重复性试验Ct均值与标准差 批内 批间重复性试验CV最大值均 5 反应体系重复性好 46 结果与讨论 5 灵敏度检测 四种曲霉菌FQ PCR灵敏度检测曲线 A fumigatus A flavus A terreus A niger 不同真菌 每一浓度均可见扩增曲线 且每一种稀释浓度的重复样本扩增比例均大于95 结果显示灵敏度均为35个孢子 ml 47 全文结论 全文结论 1 对于曲霉菌属固体组织标本 液氮研磨法提取DNA浓度 纯度高 对于曲霉菌属标准株培养的孢子冲洗标本 一步结合加热法提取曲霉菌DNA操作简单 能有效的运用于实时荧光定量PCR检测 48 全文结论 2 成功筛选出烟曲霉菌 黄曲霉菌 土曲霉菌 黑曲霉菌引物探针 并建立了曲霉菌实时荧光定量PCR