斑蝥素含量测定方法研究进展.doc

斑蝥素含量测定方法研究进展2011年39卷第l0期广州化工?49?斑蝥素含量测定方法研究进展胡朝阳(福建省产品质量检验研究院,福建福州350002)摘要:斑蝥素是一种具有特殊作用的天然活性物质,具有抗恶性肿瘤等重要l临床应用,添加到生发类化妆品中,还具有对皮肤止痒,改善局部神经营养及刺激毛根,促进毛发生长的作用,但其毒性也很强烈,化妆品卫生规范对其添加量有严格规定.本文对斑蝥素的含量测定方法进行了详细介绍.关键词:斑蝥;斑蝥素;含量测定ResearchProgressontheQuantitativeDeterminationofCantharidinHUChaoyang(FujianInspectionandResearchInstituteforProductQuality,FujianFuzhou350002,China)Abstract:CantharidinwasanaturalactivesubstancewithimportantclinicalapplicationssuchasanticancerandSOon.Addingittohairbreedingcosmetics,itcanrelieveitching,improvenutrition,stimulatethehairrootandpromotegrowthing,butitstoxicitywasalsoverystrong,SOtherewerestrictrequirementsonitsdosageforcosmetics.Thequantitativedeterminationmethodsofcantharidinweredescribedindetail.Keywords:cantharides;cantharidin;quantitativedetermination斑蝥,别名芫青,花斑毛等,是芫青科昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑蝥的虫体,性寒味辛,为剧毒中药材.斑蝥外用能蚀死肌,敷疥癣恶疮,内服有攻毒,逐瘀散结,抗肿瘤等作用.现代医学研究证明,斑蝥的药用成分主要是斑蝥素,是一种具有特殊作用的天然活性物质.近年来,斑蝥素被越来越广泛地利用,人们对其研究逐步深入.斑蝥素除具有抗恶性肿瘤等重要临床应用外,还可添加到生发类化妆品中,具有对皮肤止痒,改善局部神经营养及刺激毛根,促进毛发生长的作用,但由于毒性较大,在化妆品卫生标准对原料的要求中规定,生发类化妆品中斑蝥素的含量不允许超过l%,其他化妆品中不得含有.因此本文将对斑蝥素的理化特性,提取方法,含量测定方法作一介绍.斑蝥素(cantharidin,CA),亦称芫青素,分子式为C.H.0,分子量为196.200,学名为外一2,3二甲基一1,4氧桥一六氢化邻苯二甲酸酐,是一种天然单萜类物质,是斑蝥体内的天然防御性毒素J.斑蝥素在不同的溶剂中表现出不同的晶型,在丙酮中呈白色针状;在乙醇中呈白色糠片状;在氯仿中呈白色斜方棱柱形.熔点为215216.8.溶于丙酮(1:40),氯仿(1:65),乙酸乙酯(1:150)和油类,微溶于乙醇,乙醚和热水,不溶于冷水一.斑蝥素毒性强烈.临床研究表明,无论急性或亚急性毒性试验,口服微克量斑蝥素,各脏器皆出现病变,其中尤以肝,肾损害明显.对成人而言,斑蝥素口服致死量为30mg.因此若用药不当,很容易使人中毒甚至死亡.1理化特性2提取方法1810年,法国药物学家Robiquet从斑蝥Lyttavesicatoria中首次得到斑蝥素晶体;Piccard则于1877年提出斑蝥素的分子结构式;1914年Gadamer等证实斑蝥素的结构,如图1所示.图1斑蝥素的化学结构斑蝥素常用的提取方法是浸渍法,用乙醇,氯仿,甲苯等直接浸泡芫菁成虫,过滤,然后经多次重结晶或升华得到纯品J.斑蝥素为顺式酸酐结构,用氯仿和苯甲醚混合溶剂提取,重现性好,提取率也较高,1985年Carrell提出用浓盐酸酸化虫体后再用丙酮,二氯甲烷提取可获得比原来多的斑蝥素,经测定红头豆芫菁的斑蝥素量会比原来高出4倍,据报道用本方法可获得虫体中95%99%的斑蝥索.改良后的提取方法为将芫菁成虫自然风干,然后用丙酮,氯仿及少量浓盐酸的混合溶液于脂肪提取器上沸腾回流12h,滤去残渣,将溶液浓缩近干,用重结晶法制得白色片状结晶物即斑鳌素.李晓飞等建立了上层酸水解,下层氯仿浸提的方法,省略原方法中浓缩和过柱的步骤,简化了操作,节约了成本.杨兆芬等报道红头豆芫菁经110烘干后的雄虫,用酸水解后提取作者简介:胡朝阳(1981一),男,工程师,主要从事色谱分析.Email:hzy5520126.c0m?5O?广州化工2011年39卷第l0期的斑蝥素含量比直接提取的含量增高4倍.张振凌等用氢氧化钠溶液煎煮处理成功提取出斑螫素;梅清华等研究证实了超声波超声波提取工艺可行.杨清林等通过正交试验研究了斑鳌中斑鳌素的提取_T艺,选择丙酮为提取溶剂,得到最佳条件为回流提取,即用7倍量的丙酮,浸泡3h,回流提取3次,每次lh.而高阳等副通过斑蝥药材指纹图谱分析方法综合比较了振荡静置法,超声波振荡法,及热回流法之间的差异,得出了斑蝥药材最佳提取工艺:即以15mL氯仿热回流提取3h.王贤英等应用丙酮回流,超声,冷浸等方法提取斑蝥,采用高效液相色谱法测定斑蝥中斑蝥素的含量.结果显示冷浸提取效率高,斑蝥素含量高.而且无污染,环保节能,适用于大规模生产.3含量测定方法斑蝥素较为稳定,在其鉴定方法方面,2000年我国药典确定用薄层扫描法:将斑蝥素溶于氯仿中制成5mS/mL斑蝥素氯仿溶液,点于硅胶G薄层板上,以氯仿:丙酮(49:1)为展开剂,晾干后喷以0.1%溴甲酚绿乙醇溶液,加热至斑点显色清晰,斑点为黄色.而斑鳌素含量测定方法己报道的有重量法,酸碱法,紫外分光光度法,高效液相色谱法,气相色谱法等.3.1重量法用适当的沉淀方法将被测组分从试样中离析m来,称其质量,从而计算该组分的含量,称为重量分析法,简称重量法.重量法的一般步骤如下:从以上分析步骤可看到,重量法不需要基准物质或标准物质作参比,通过直接沉淀和称量而测得物质的含量,因此,其测定的结果的准确度很高.一般分析天平称量的误差不大于0.2nag,只要沉淀处理得当,重量法的相对误差不会超过称量的相对误差.若称量形式为0.10.2g,相对误差约0.1%0.2%.因此,许多重量法至今仍列为标准方法.Ft本,美国,英国药典就曾采用重量法测定斑蝥素的含量.重量法的缺点是操作冗繁,分析周期长,也不适用于微量组分的测定.但由于它有不可替代的特点,目前在常量的S,Ni,P,Si等元素或其化合物的定量分析中还经常使用.3.2酸碱滴定法酸碱滴定法又简称酸碱法,是指利用中药成分在水中的溶解性与酸碱度有关的性质,在溶液中加入适量酸或碱,调节pH值至一定范围,使这些成分溶解或拆出,以达到提取分离的方法.1995版中国药典规定采用酸碱滴定法测定斑蝥素的含量.王广生等参照药典利用酸碱法测定斑蝥素的含量取得了较好的效果.酸碱法具有设备易实现,通用性强的优点,其缺点在于样品中斑蝥素的含量不得少于0.6%,而且能量消耗大,反应时间长,设备腐蚀严重以及废水污染严重等.3.3紫外分光光度法分子吸收波长范围在200400llm区间的电磁波产生的吸收光谱称为紫外吸收光谱(UltravioletAbsorptionSpectra),简称紫外光谱(uv).紫外分光光度法是根据物质分子对波长为200400nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性,定量和结构分析方法.操作简单,准确度高,重现性好.刘力等用紫外分光光度法测定斑蝥虫体中斑蝥索的含量,按药典法提取,虫体6o干燥1h后用氯仿溶解,60水浴挥去氯仿,真空干燥,然后用紫外分光光度计在228rim测得2批斑蝥全虫体中斑蝥含量分别为1.183%和1.113%,与我国药典规定的酸碱法一致,回收率99.98%.斑蝥素的紫外吸收较弱,该实验利用溶剂效应增强了斑蝥素存紫外区域的吸收值,因此使uV法能用于测定斑蝥索的含量,另外该方法斑蝥素取样量仅是酸碱法的1/10左右,操作简便,方法可靠,具有重要的参考价值.3.4气相色谱法气相色谱法是指用气体作为流动相,根据分配系数不同而达到分离的一种检测技术.丁在福在国内首次尝试用气相色谱法对斑蝥中的斑蝥素的含量进行了系统的研究.谭娟杰等通过用气相色谱法测定郭公甲科红斑郭公虫和蝉科黑翅红娘子两种常与斑蝥中药名混肴的昆虫不含斑蝥素,进一步证明气相色谱法对测定斑瞀素具有专属性.因本法简便,灵敏度高,回收率高,重现性好,2005年药典规定用气相色谱法测定芫菁虫内斑鳌素含量.育发类保健用品一般含有多种中药材的乙醇提取液,成分复杂.赵松华等建立了0VI7填充柱气相色谱法测定育发类保健用品中斑螯素含量,经实际样品测定,效果较好.化妆品尤其是育发类制剂中多含有表面活性剂成分,采用化妆品卫生规范氯仿液一液萃取的方式难以定量分析,赵月朝等使用无水硫酸钠吸除化妆品中水分,使样品由液态转化为固态,再用氯仿进行液一固萃取,气相色谱法定量测定含化妆品中斑蝥素,改善了化妆品中斑蝥素测定的可靠性和准确性.刘高强等采用程序升温毛细管气相色谱法建立了灵芝等药用真菌转化中微量斑蝥素含量的检测方法.该方法可用氯仿直接萃取发酵液,进行上机测定,无需对斑蝥素进行进一步纯化分离.3.5高效液相色谱法高效液相色谱法是以液体作为流动相,并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术.该方法已成为化学,医学,T业,农学,商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术.周祥敏等_2建立了测定斑蝥中斑蝥素含量的高效液相色谱方法:以C18色谱柱为分析柱,乙腈水(80:20)为流动相,检测波长为209rim,结果显示斑蝥素进样量在0.40122.0060范嗣内与峰面积呈线性关系,平均回收率为lO0.1%,RSD为2%.覃柳珍采用反相高效液相色谱法,以C18一ODS为固定相,选用乙腈一水(40:60)为流动相,检测波长210llm.结果显示斑螫素浓度存0.5025.02g/mL范围内线性关系良好,回归方程为A:19702.6C+132.555,r=0.999(n:6),平均加样回收率为101.18%(RSD=1.9%).以上均说明高效液相色谱法准确可靠,可以用于斑螫素的含量测定.3.6气质联用法联用技术(HyphenatedMethod)就是将2种或多种方法结合起来的技术.气相色谱一质谱(GCMS)集合了气相色谱法的高速度,高效分离能力,高灵敏度和质谱的高选择性于一体,因而,近年来,GCMS技术被广泛应用于食品,材料,医药,生命科学,环保,能源等领域,其适用于含有易挥发或易衍生化合物样品的分析.GCMS技术可同时对混合的复杂样品进行分离,定量,定性分析.国外已有文献报道采用气质联用法测定生物组织及血清中斑蝥素的含量.李英等用氯甲烷为提取剂,以M/Z128为定量离子,采用气相色谱/质谱一选择离子储存技术(GC/MSSIS)对生发类化妆品中斑蝥素的含量进行测定,线性范围为】50/zg/mL,检f限为0.2ng,回收率为91.O%97.1%,相对标准偏差为0.80%(n=6),显示该方法简便,快速,准确.2011年39卷第l0期广州化工?5l-4结语综上所述,斑蝥素含量测定方法经过多年的摸索与探索,到目前为止,人们一般以气相色谱法作为测定斑蝥素含量的主要途径.为了更有效,准确地定量分析复杂组分中的微量斑蝥素,人们在气相色谱分析的基础上进一步摸索了高效液相色谱法以及气质联用法,对于不同来源的样品,几种不同的含量测定方法各有利弊.我们存实际丁作中应突破常规的思路,细一fi,观察,因为更简便,灵敏,准确的斑蝥素含量测定方法尚待深入研究.参考文献1南开大学,中山大学,北京大学,等.昆虫学(上册)M.北京:人民教育出版享十,l982:148一I73.2中华人民共和国卫生部.化妆品卫生规范S.2002,3:367.3张曙明,樊瑛.我国药用昆虫研究应用的回顾与展望J.昆虫知识,1992,29(1):5457.4WoodwardRB.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