第3章 微生物细胞的破碎技术 2005.06.doc

第3章 微生物细胞的破碎知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。难点：常用破碎方法的合理选用。一细胞的破碎技术概述采用微生物发酵或动植物细胞培养时，如果目标生化物质为胞外产物，如霉菌产生的糖化酶等，提取过程较简单，只需直接进行固-液分离，获得澄清的滤液，再进行分离纯化操作；如果目标生化物质为胞内产物，如碱性磷酸酶等胞内酶、部分外源基因表达产物或植物细胞产物等，则要对菌体或细胞进行适当的处理，选择性地释放目标生化物质到液相中，然后进行固-液分离去除细胞及其碎片，再进行目标生化物质的分离纯化。由于细胞的结构根据细胞种类而异，动物、植物和微生物细胞的结构差异很大。动物细胞、嗜盐菌和支原体没有细胞壁，易于破碎。植物细胞和微生物细胞有一层坚固的细胞壁，破碎困难，需用较强烈的破碎方法。因此，本课程主要介绍微生物细胞的破碎技术。所谓的微生物细胞破碎就是使微生物的细胞壁或细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，增大胞膜通透性，使胞内产物获得最大程度的释放,便于所需的生化物质的提取和分离的一种操作。本质上这是一种增溶作用，其主要阻力来自于各种微生物细胞壁的结构和组成的差异。由于各种微生物细胞壁的结构和组成的差异导致细胞破碎的难易程度不同。因此，了解微生物细胞壁结构和强度对判断细胞破碎的难易程度和选择合适的细胞破碎方法有着十分重要的意义。表1所示为各种微生物细胞壁的结构和组成。表1 各种微生物细胞壁的结构与组成微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚/nm20801013100300100250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖（40%90%）酯多糖（1%4%）多糖细胞酸蛋白质肽聚糖（5%10%）酯多糖（11%22%）酯蛋白磷脂蛋白质葡聚糖（30%40%）甘露聚糖（30%）蛋白质（6%8%）脂类（8%14%）多聚糖(80%90%)脂类蛋白质由表1可知，微生物的细胞壁都是由网状的高分于聚合物构成，破碎的难易程度主要取决于构成细胞壁的聚合物的种类以及细胞壁的厚度和强度。如革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌坚固，较难破碎。酵母的细胞壁的厚度甚至超过革兰氏阳性菌的细胞壁，更难破碎。几乎所有细菌的细胞壁都是由具有网状结构的肽聚糖组成，肽聚糖包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。破碎细菌的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。酵母细胞壁的主要成分为葡聚糖、甘露聚糖、脂类和蛋白质等，仅有一部分厚度对酵母细胞壁的刚性和强度起重要作用。破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。大多数霉菌的细胞壁主要由多糖，尤其是具有-1，4糖苷键的几丁质和-1，6糖苷键的葡聚糖组成，还含有较少量的蛋白质和脂类。破碎霉菌细胞壁的阻力主要决定于霉菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构，还有几丁质或纤维素的纤维状结构。海藻类的细胞壁非常复杂，主要结构成分是纤维状的多糖类物质。破碎海藻细胞壁的阻力主要取决于纤维素的-1，4糖苷键结构。因此，微生物破碎的难易程度主要取决于构成细胞壁的高分子聚合物的种类以及细胞壁的厚度和强度，为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状结构的共价键。在破碎中，细胞的大小和形状以及聚合物的交联程度均是影响破碎难易程度的重要因素。在用酶法或化学法破碎时，细胞壁结构和组成可作为选择酶或化学试剂的依据，如革兰氏阳性菌主要由肽聚糖组成，可直接采用溶菌酶裂解-1，4糖苷键进行破壁，而革兰氏阴性菌因存在脂蛋白和脂多糖，则只有在螯合剂存在时才能受溶菌酶作用。二胞破碎的原则破碎细胞的目的是要得到一种或几种有用的目标生化物质。由于细胞之间以及目标生化物质之间的性质差别很大，已有的破碎理论和破碎实验数据只能作为指导破碎操作的参考依据，实际的破碎操作仍需凭借经验，即需通过实验确定适宜的破碎器和破碎操作条件，获得最佳的破碎效率。因此，在细胞内存在的许多种物质中，选择性释放目标生化物质，而使其他物质尽量少地释放出来，并且尽量降低细胞的破碎程度，在保证目标生化物质有较高收率的前提下，使下游加工过程的成本最低。这对下游分离纯化操作的顺利实施是非常重要的。如利用珠磨法破碎酵母细胞时，酵母内各种酶的释放速度常数不同。一般靠近细胞壁和细胞膜的酶释放速度快，而细胞内部或细胞器内的酶随破碎的进行缓慢释放出来。选择性地释放目标生化物质的关键是要根据目标生化物质的性质和在细胞内存在的位置来选择适当的破碎方法和操作条件。一般原则有以下两个方面：仅破坏或破碎存在目标生化物质的位置周围：当目标生化物质存在于细胞膜附近时，可采用较温和的方法，如酶解法、渗透压冲击法和冻结-融化法等。当目标生化物质存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法。选择性溶解目标生化物质：当目标生化物质处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调整溶液pH值、离子强度或添加与目标生化物质具有亲和性的试剂如螯合剂、表面活性剂等。使目标生化物质容易溶解释放。所选的溶液体系应使其他杂质不易溶出。三破碎率的测定破碎细胞仅为目标生化物质的释放创造了条件，而不是最终目的。破碎细胞的目的是释出目标生化物质，因此，细胞的破碎速率一般用目标生化物质的释放速率评价。由于破碎方法、细胞种类和目标生化物质在胞内位置不同，目标生化物质的溶解速率也不同，因此，细胞破碎和产物溶解过程非常复杂，很难完全定量描述。为了测定细胞破碎的程度，可采用以下2种方法：直接测定法：利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞的量，可用于破碎前的细胞计量。采用染色法把破碎的细胞从未损害的完整细胞中区别开来，以便于计数。例如，破碎的革兰氏阳性菌常可染色成革兰氏阴性菌的颜色，利用革兰氏染色法未受损害的酵母细胞呈现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色。测定释放的蛋白质量或酶的活力：细胞破碎后，测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。通常将破碎后的细胞悬浮液离、测定上清液中蛋白质的含量或酶的活力，并与100%破碎所获得的标准数值直接比较。细胞破碎和产物溶解过程非常复杂，很难完全定量描述。四常用破碎技术细胞破碎的目的是选择性释出胞内产物，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类（表1）。机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力，非机械破碎主要利用化学或生化试剂(酶)改变细胞壁或细胞膜的结构而释放胞内物质。表1 机械破碎法与非机械法比较2比较项目机械法非机械法破碎机理切碎细胞溶解局部壁膜破片大小碎片细小细胞碎片较大内含物释放全 部部 分粘 度高（核酸多）低（核酸少）时间、效率时间短、效率高时间长、效率低设 备需专用设备不需专用设备通用性强差经 济成本低成本高应用范围实验室、工业范围实验室范围不管是机械法还是非机械法，各种方法都有自身的局限性。多种破碎方法相结合是一个发展方向。微生物细胞破碎技术的未来发展方向主要集中在如下几个方面：多种破碎方法相结合：如机械破碎前，先用硫醇处理酵母细胞，利用酶活激活糖苷酶，从而去除细胞壁中得的糖，使细胞壁强度减弱，可以大大提高胞内蛋白的收率。如：用溶菌酶预处理面包酵母，然后采用高压匀浆机，在9.5 MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100，而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32。与上游过程相结合：菌体破碎的难易程度与发酵培养过程的条件息息相关。可通过改变培养基的组成、发酵条件等因素或者利用基因工程方法对菌种进行改造。如：克隆噬菌体溶解基因，表达耐高温产品的基因等。与下游过程相结合：从整体角度考虑细胞的破碎程度，避免因细小碎片无法除净而导致后续的固液分离和纯化过程的难度增大。表3则列出了细胞破碎一些主要方法，其中高速湿法珠磨法和高压匀浆法已经在工业生产中广泛应用，酶解法和化学溶胞法也大量应用于实验室规模的细胞破碎中，超声破碎法和微波破碎法的实验室研究开发相当活跃。表3 细胞破碎主要方法 分类作用机理适应性（或选用策略）机械法高速湿法珠磨固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压均浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作非机械法酶解法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学溶胞法改变细胞膜的渗透性具有一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差渗透压冲击法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感的目的产物干燥法改变细胞膜的渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 细胞破碎主要采用各种机械破碎法和非机械破碎法，或机械和非机械破碎法的结合。机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力，非机械破碎主要以化学渗透的方式起作用，系利用化学或生化试剂(酶)改变细胞壁或细胞膜的结构而释放胞内物质。各种作用力的细胞破碎机理示于图2。图2 细胞破碎机理1）机械破碎法机械破碎法是工业规模细胞破碎的主要手段，具有处理量大、破碎效率高、速度快等特点，适用于植物材料和细菌细胞的破碎。其破碎原理主要基于对物料的液相或固相剪切作用。这些剪切力可以在高压匀浆器、高速珠磨机、胶质磨或高速组织捣碎机等设备中获得。由于各种机械破碎法的作用机理不尽相同，有各自的适用范围和处理规模。因此，针对目标生化物质的性质选择细胞破碎设备并确定适宜的破碎操作条件是非常重要的。但由于这种剪切力场之间的相互作用较复杂，工程设计大多数靠经验。本法常用的设备有细菌磨，高速珠磨机(图1)，胶质磨，撞击破碎器(图2)，高速组织捣碎机，匀浆器(图3)和电声超声波发生器(图4)等。研磨法是将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，利用玻璃小珠撞击微生物细胞使达到细胞的某种程度破碎，是一种常用的机械破碎方法，其原理是利用固体间的机械剪切力，适用于植物材料和细菌细胞的破碎。研磨法常用的设备有细菌磨，高速珠磨机，胶质磨，高速组织捣碎机和匀浆器等。珠磨是一种常用的机械破碎细胞的方法，利用玻璃小珠与细胞悬浮液一起快速搅拌。由于研磨作用，使细胞获得破碎，常用的工业设备是高速珠磨机。适用于绝大多数微生物细胞的破碎。如：采用高速湿法珠磨分离纯化重组人肿瘤坏死因子时，菌体经间歇式珠磨机破碎3 min，玻璃珠直径为0.25-0.50 mm，装珠量为破碎室总体积的85%，搅拌转速1500 r/min，破碎液于4,15000 r/min离心15 min后去除细胞碎片。本条件下，目标蛋白回收率可达90.3%，活性回收率为85.8%。但与高压匀浆法相比，影响破碎率的操作参数较多，操作过程的优化设计较复杂。如面包酵母菌破碎时，破碎速率与诸如搅拌转速、料液的循环流速、细胞悬浮液的浓度、玻璃小珠的装置和珠体的直径以及温度等许多操作参数有关。提高搅拌速度，增加小珠装量，降低酵母悬浮液的浓度和通过磨机的循环速率均可增大破碎效率。由于珠磨破碎操作的有效能量利用率仅为1左右，破碎过程产生大量的热能。因此，在设计操作时应充分考虑换热能力问题。图 高速珠磨机的结构简图撞击破碎是另一种常用的机械破碎细胞的方法，其原理是将弹性体的细胞进行冷冻，使其成为刚性球体，从而降低破碎的难度，适用于大多数微生物细胞和植物细胞的破碎。具体做法是浓度为 1020的细胞悬浮液以喷雾状高速冻结形成粒径小于50m的微粒子。高速载气将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。撞击破碎的特点是：细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬间，细胞破碎程度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎的现象。细胞破碎程度可通过无级调节载气压力(流速)控制，避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器(如线粒体、叶绿体等)的回收。图 是撞击破碎器的结构简图。图 撞击破碎器的结构简图组织捣碎法采用组织捣碎机，利用液固间的剪切力对动物组织、植物组织等进行间歇的剧烈的破碎，一般间歇时间为30-45 s/每次，最高转速1-2万rpm。适用于动物组织、内脏、植物种子、嫩菜叶、较柔软的果蔬等的破碎。但由于旋转刀片的机械剪切力较大且破碎过程中温度易迅速上升，不适于核酸等生物大分子的提取。高压匀浆破碎又称高压剪切破碎法，是利用微生物细胞在高压作用下，通过一个狭窄的孔通高速冲出，由于突然减压而引起一种空穴效应，同时由于高速冲击和撞击环而引起细胞的破碎。适用于大多数微生物细胞的破碎，例如酵母菌、大肠杆菌、巨大芽抱杆菌和黑曲菌等，料液细胞浓度可达到20左右。如：提取酵母醇脱氢酶时，可采用高压匀浆法对废弃啤酒酵母细胞进行破碎，压力为70 MPa，15%浓度的酵母液均质2-3次破碎率可达90%。但某些高度分枝的微生物，如团状菌和系状菌易造成高压匀浆器堵塞，使操作发生困难，般不宜使用该法。高压匀浆法中影响细胞破碎的因素主要有压力、循环操作次数和温度。在工业生产中，操作压力通常采用5570MPa。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。某些较难破碎的细胞，如小球菌，链球菌、酵母菌和乳酸杆菌等，以及处于生长静止期的细胞或通入的细胞浓度较高时，应采用多次循环的方式才能达到较高的破碎率。破碎性能还随微生物种类和生长环境而异，例如采用高压匀浆法时。大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，但是生长在复杂培养基中的细胞比生长在合成培养基中的细胞难破碎， 图 高压匀浆器结构简图高压挤压法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-250C至-300C形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。由于突然减压而引起一种空穴效应，同时由于高速冲击和撞击而引起细胞的破碎。适用于实验室中多数微生物细胞的破碎，不适用于对冷冻-融解敏感的生化物质。常用的设备为French压榨器。该法适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高。超声波破碎是采用超声波破碎机在15到25千赫（kHz）的频率下操作，由于超声波具高频率、短波长、定向传播等特点。超声波在液体中传播时使液体中某点某瞬间受到巨大的压力，而另一瞬间压力又迅速消失，产生巨大的拉力使液体拉伸而破裂并出现细小空穴，这种空穴在超声波的继续作用下又迅速闭合，产生极强的局部附加压强（达几万个大气压），介质中的悬浮细胞在如此大的压力作用下产生一种应力促使内部液体流动而使细胞受到破碎。适用性于实验室规模的微生物细胞破碎，不适于大规模生产。如：大肠杆菌湿菌体加入10倍量pH 7.7的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液，超声波处理10 min可释放90以上的酶。提取重组人白细胞介素时，可用超声破碎法处理大肠杆菌，破坏白细胞介素包含体，释放出白细胞介素。当超声功率480 ，菌体浓度为100 g/L，去离子水中超声破碎15 min，表达量为20%的菌体可获得包含体的含量为40%。用超声破碎法对谷氨酸菌体破碎条件优化时，菌体浓度50 gL，破碎时间12 min，破碎器输出功率200 W时，蛋白释放率可达58以上。常用的设备为电声超声波发生器，它是由发声器和换能器组成，发声器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器又可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。 超声波处理细胞悬浮液时，破碎作用受许多因素的影响，如超声波的声强、频率、液体的温度、压强和处理时间等，此外介质的离子强度、pH值和菌种的性质等也有很大的影响。不同的菌种。用超声波处理的效果也不同，杆菌比球菌易破碎，革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌易破碎，酵母菌效果较差。 图 电声超声波发生器简图2）非机械方法微生物细胞常用的非机械破碎法有：酶解、热处理、渗透压冲击、反复冻结-融化、化学溶胞和干燥等。非机械破碎方法的处理条件一般比较温和，有利于目标生化物质的高活力释放回收，但这些方法破碎效率较低、产物释放速度较慢，处理时间较长，多局限于实验室规模的小批量应用。酶解法是利用水解酶的专一性酶解反应分解破坏细胞壁上的特殊的键而达到破壁目的，适用于小规模的实验室研究。应用酶解需要选择适宜的酶和酶系统，并要决定特定的反应条件，还常附加其它的处理，如辐照、渗透压冲击、反复冻融等或加金属整合剂EDTA，或者利用生物因素等促使微生物对酶解作用敏感，以获得一定的效果。溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的-1,4糖苷键，使脂多糖分解，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。例如在巨大芽抱杆菌或小球菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶菌现象。其它常用酶还有蛋白酶、脂酶、核酸酶、纤维酶、透明质酸酶等。酶解的方法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可采用自溶作用。自溶法是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶可通过调节温度、pH或添加有机溶剂等方法由微生物本身产生，微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合结构的酶，以使生长过程得以延续，但改变微生物的环境因素（如温度、pH、时间、压强、缓冲液浓度、细胞代谢途径等）可诱发产生过剩的该种酶或激发产生其他自溶酶而达到自溶的目的，自溶可能是细胞不平衡生长的结果，也可能是自身酶类活化的结果。微生物细胞的自溶常采用加热法或改变pH。例如，3谷氨酸菌悬浮液，加热至70C，保温搅拌20分钟。菌体即自溶。酵母在4550下保温20小时左右，可发生自溶。卡那霉素产生菌发酵结束时，改变pH至1.5-2.0，菌体即自溶。自溶法适用于工业规模的含有不易提制的酶或其他生化物质的微生物细胞的破碎，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。细胞壁合成抑制法能导致类似于酶解的结果。某些抗生素如青霉素或环丝氨酸，能阻止新细胞壁物质的合成。如庆大霉素、西索米星等胞内产物产生菌，通过添加胞壁合成抑制剂，如青霉素、杆菌肽等，能使胞内产物转移至胞外，利于后续的分离提取。抑制剂应在发酵过程细胞生长期的后期加入、只有当抑制剂加入后，生物合成和再生还在继续进行，溶胞的条件才是有利的。这样在细胞分裂阶段存在的细胞壁有缺陷，故能达到溶胞作用。因自溶法时间较长，常需要添加少量防腐剂（如甲苯、氯仿等）防止细菌滋生和污染。化学溶胞法是采用添加酸、碱、脂溶性有机溶剂及表面活性剂等，溶解细胞膜上的脂质化合物或水解蛋白质，使细胞结构破坏，而将胞内产物抽提出来。化学试剂处理是利用离子型表面活性剂SDS、脱氧胆酸钠、非离子型表面活性剂吐温-80等使蛋白质变性，改变膜双层脂蛋白结构而达到破碎细胞的目的。如：对胞内的异淀粉酶，可加入0.1%十二烷基硫酸钠或0.4% triton X-100于酶液中，30C振荡30小时，就能较完全地将异淀粉酶抽提出来，且酶的比活较机械破碎法的高。如：从大肠杆菌中提取L-天冬酰胺酶时，常用2Triton X-100和12.5 K2HPO4溶液处理菌体，可释放70以上的酶。酸碱处理是基于蛋白质为两性电解质，改变pH可改变其荷电性质，使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的相互作用力降低而易于溶解。因此，利用酸碱调节pH值，可提高目标生化物质溶解度。用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分，酸处理可以使蛋白质水解成游离氨基酸。如工业化生产西索米星抗生素时，常采用酸化处理的方式进行细胞破壁。调发酵液pH值至1.82.0进行酸化处理，西索米星释放率可达90%左右，而采用1%的溶菌酶37酶解30 min、超声波破碎处理30 min(振荡20 s停10 s)或1% SDS处理10 min时，西索米星释放率均不足50%。微波破碎是利用微波场进行细胞破碎的方法。适用于热稳定的生化物质，如多糖、低聚糖、生物碱、黄酮、皂甙等成分，但不适用于热敏性生化物质，如蛋白质、酶和多肽等，也不适用于富含淀粉或树胶的植物。渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞在高渗溶液（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液）平衡一段时间后，介质突然被稀释或突然转入到水溶液或缓冲溶液中，细胞因渗透压的突然变化而引起细胞壁的破裂，从而达到破碎细胞的目的，是一种实验规模常用破碎方法，一般运用于细胞壁较脆弱的菌种或细胞壁已经预先酶处理。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌体，如动物细胞和革兰氏阴性菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。其原理是：细胞在高渗溶液中收缩，胞内水分外渗，产生质壁分离现象；当细胞转入水或低渗溶液中，细胞开始溶胀，质壁分离的间隙消失。由于这种渗透压的冲击作用导致细胞破碎使胞内物质释放。如直接将待破碎的酵母菌投入低渗溶液（如H2O、稀NaCl溶液、稀有机溶剂等）由于溶剂分子的大量渗入细胞而引起膜的膨胀，当膨胀达到一定程度时，亦会发生破裂达到细胞破碎的目的。反复冻结-融化是将细胞放在低温下（-15oC）下突然冷冻令其凝固，然后在室温下融化令其溶解，如此反复多次而达到破壁的作用。反复冻结-融化破壁的机理有两方面：生物膜结构是双层脂质和蛋白质组成，维持膜结构的一部分作用力为疏水键。由于冷冻，一方面能使用细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加了细胞的亲水性能，另一方面由于细胞内水结晶形成冰粒，使细胞内外溶液浓度变化，盐浓度升高而引起细胞突然膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体、动物性细胞的破碎或释放某种细胞成分，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效，由于可能引起对冻融敏感的一些蛋白质的变性，因此对冷冻-融化敏感的生化物质不适用。而且溶质是靠分子扩散释放出来，速度缓慢，破碎效果不显著。干燥法采用空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等方法，或者采用丙酮等有机溶剂处理菌体，使干燥后的菌体细胞膜渗透性发生改变，同时部分菌体会产生自溶，从而破坏细胞膜双层脂蛋白结构而达到破碎细胞的目的。干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。酵母菌常用空气干燥，一般在2530c的气流中吹干，部分酵母产生自溶，然后用水、缓冲液或其它溶剂抽提。空气干燥时，部分酵母可能产生自溶，所以较冷冻干燥，喷雾干燥容易抽提。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质，将冷冻干燥后故菌体在冷冻条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。有机溶剂干燥法，可将菌体悬浮液慢慢倒入10倍体积预冷至-20c的丙酮中搅拌，利用丙酮破坏细胞蛋白质和脂类的结合，使细胞脱水，溶解除去膜上部分脂肪，胞内物质就容易被抽提出来。如：无锡酶制剂厂的-淀粉酶、-淀粉酶、脱支酶等。五包含体的破碎外源基因在微生物宿主中表达能产生重组蛋白，当重组蛋白高度表达时，将导致在细胞中形成包含体。一般地，包含体在透视性相差显微镜下为不透明的颗粒，