生命科学专题RNAiPPT课件

-,1,梅洛(CraigMello)生于1960年，是被恐龙骨引入科学世界的。梅洛童年时经常跟着父亲在美国西部寻找化石。从那时起，他就迷上了远古时代、地球历史和人类生命的起源等问题。高中时代，梅洛的兴趣逐渐转移到了基因工程方面。,法尔(AndrewFire)1959年出生在美国加利福尼亚州，本科在加利福尼亚大学伯克利分校主修数学，仅用3年时间就拿到学位。与梅洛类似，他逐渐对涉及生命奥秘的遗传学产生兴趣，并将其作为自己终身的学术追求。,-,2,RNA干扰,RNAinterference，RNAi,南通大学生命科学学院谭湘陵,-,3,一、RNA干扰的发现,94年Cogoni等证明真菌中亦有类似现象，此称为基因压制(quelling)。,90年代初，美国和荷兰的两个转基因植物实验组RichJorgensen和同事,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现:将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。也就是说转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，Jorgensen将这种现象命名为共抑制(cosuppression),-,4,一、RNA干扰的发现,-,5,一、RNA干扰的发现,-,6,Negativecontrolshowinglackofstainingintheabsenceofthehybridizationprobe.(B)Embryofromuninjectedparentshowingnormalpatternofendogenousmex-3RNA(purplestaining).(C)Embryofromparentinjectedwithpurifiedmex-3antisenseRNA.Theseembryos(andtheparentanimals)retainmex-3mRNA,althoughlevelsmaybesomewhatlessthanwildtype.(D)Late4-cellstageembryofromaparentinjectedwithdsRNAcorrespondingtomex-3;nomex-3RNAisdetected.(TemplatesusedforinterferingRNAandinsituprobeswerelargelynon-overlapping.),Effectsofmex-3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNA.NomarskiDICmicrographsshowinsituhybridizationof4-cellstageembryos.,-,7,一、RNA干扰的发现,2001年，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。Nature，2001，411（6836）：494498RNAi技术被Science评为2001年度的十大科技进展之一。,-,8,二、RNA干扰的机制,dsRNA：双链RNA，包含正义链和反义链Dicer：属于RNase家族，是dsRNA的特异性核酸内切酶siRNA：smallinterferingRNA，RNAi的关键效应分子，21-23个nt大小的双链RNARISC：RNA-inducingsilencingcomplex，具有核酸内切、外切以及解旋酶活性RdRP：RNA-dependentRNApolymerases，依赖RNA的RNA聚合酶，是RNAi的调节因子，使RNAi可以在生物体内传递,预备知识：,-,9,基因沉默,二、RNA干扰的机制,转录水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)转录后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS),TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默。对于部分植物来说，转基因引发的基因沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致；PTGS则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。,基因沉默,-,10,目前普遍认为，共抑制、基因压制和RNAi很可能具有相同的分子机制，都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA,抑制相应基因的表达。均属于PTGS！现已初步阐明dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步：,二、RNA干扰的机制,第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNase样的特异核酸酶切割加工成2123nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。,siRNA的两条单链末端为5-磷酸和3-羟基，且3端均有2-3个突出的核苷酸。果蝇中的RNase样核酸酶称为Dicer。Dicer有解旋酶活性并含有dsDNA结合域和PAZ结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。,-,11,二、RNA干扰的机制,第二步（效应阶段）是siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。,活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。,RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。,-,12,RNAi的放大效应机制,二、RNA干扰的机制,siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。新合成的长链dsRNA同样可被RNase样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（randomdegradativePCR）。,-,13,GiselaStorz,Science,296(5571):1263-1265,2002.,-,14,RNAi是转录后水平的基因沉默机制；RNAi具有很高的特异性；只有dsRNA才能诱导产生RNAi；只有针对编码区的dsRNA才能产生有效的和特异性的干扰；注射同源dsRNA可以引起内源性mRNA特异性的降解；RNAi抑制基因表达具有很高的效率，可达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达，这是通过催化放大的方式进行的；,二、RNA干扰的机制,RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征：,-,15,二、RNA干扰的机制,RNAi抑制基因表达的效应可以长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传给F1，但F2往往恢复为野生型。dsRNA不得短于21个碱基，大于30bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；RNAi作用迅速，mRNA快速降解；RNAi效应的依赖性，只有连续产生dsRNA才能产生长期效应，否则只产生短暂的沉默反应。,RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征：,-,16,三、RNA干扰的应用,1.基因功能研究,由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。,-,17,三、RNA干扰的应用,2.病毒性疾病的治疗,研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5进入人体外周淋巴细胞，而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。,艾滋病,-,18,三、RNA干扰的应用,2.病毒性疾病的治疗,Shlomai和Shaul设计了各针对HBV基因19nt的两种pSUPER载体：pSUPERX-siRNA和pSUPERcore-siRNA。已转染含1.3XwtHBV基因质粒载体的Huh7细胞再被X-siRNA或core-siRNA转染后，core蛋白水平分别降低了89%、63%，转染X-siRNA的细胞中HBsAg降低60%，但转染core-siRNA对HBsAg表达无明显影响（X-siRNA干扰沉默了所有的病毒转录物，而core-siRNA仅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA）。,HBV,-,19,三、RNA干扰的应用,2.病毒性疾病的治疗,Randall等证明了针对HCVRNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCVRNA降低80倍；将siRNA转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用；siRNA干扰沉默HCVRNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等也证明了siRNA特异抑制HCVRNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。,HCV,-,20,三、RNA干扰的应用,2.病毒性疾病的治疗,RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。在最近全世界约30个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)的防治研究中，RNAi也受到了重视。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的治疗。,其它病毒,-,21,三、RNA干扰的应用,3.肿瘤治疗,用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。,(1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因，(2)RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达，(3)RNAi可应用于抑制基因扩增。,Li等在3个肝癌细胞系Hep3B、HepG2、SNU449中对cyclinE的研究中发现，转染siRNA组48h后生长抑制均达到90，而对照组无作用，3天后凋亡率分别为16、44和3l，而对照组仅为l。,-,22,三、RNA干扰的应用,3.肿瘤治疗,Survivin基因是迄今为止克隆出的最小凋亡抑制蛋白家族成员，可通过抑制caspase级链反应下游的caspase3，caspase7发挥其抗凋亡作用。现在研究已证实survivin基因参与了肝癌的发生与发展，并且还与化疗的耐药性相关。降低survivin基因在肝癌细胞中的表达不仅可诱导肝癌细胞的凋亡、抑制肝癌细胞的生长，还可增强其对化疗的敏感性，从而提高肝癌治疗的整体疗效。CHENG等通过RNAi抑制肝癌细胞SMMC7721中survivin基因的表达，使细胞株中survivin基因表达几乎缺失，凋亡指数增加156，肝癌细胞生长被抑制。,-,23,三、RNA干扰的应用,3.肿瘤治疗,MDR(Muhidrugresistance)是肿瘤化疗失败的主要原因，形成MDR的最常见的因素是肿瘤细胞MDR基因编码的糖蛋白过度表达，其中，MDR1对于细胞的多重耐药性起着重要的作用。Nieth等表明，特异siRNA可以抑制MDR1基因的表达，从而显著降低肿瘤细胞的耐药性。,PLK1基因在很多种癌症时都呈高度表达，当使用RNAi技术减少其表达后，所有癌细胞的PLKlmRNA和蛋白水平都有显著降低，如MCF-7乳腺癌细胞的PLKlmRNA下降了7O，蛋白水平下降了90，而且细胞凋亡率提高了百分之几至50不等。所以，PLK1的siRNA具有抵抗癌细胞的增殖作用，是一种治疗癌症的新途径。,-,24,三、RNA干扰的应用,4.药物开发,利用RNAi技术来研究药物作用的特异性和机制对于加快药物开发的研制速度大有益处，因为基因组研究成果和高通量的筛选技术，为更好更快发现药靶和候选药物提供了重要基础。在药物开发过程中，用RNAi技术可以对靶基因的功能进行分析，有助于搞清药物的作用机制以及与基因编码产物，及与相应化合物的相互作用，从而更正确地发现药靶，开发更有效的候选药物。,-,25,四、RNA干扰的研究方法,一般技术路线,-,26,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的设计,1.从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。2.将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST3.选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。,-,27,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的设计,4.一个完整的siRNA实验应该有阴性对照。作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。,5.计算机软件辅助设计，如Rational_siRNA_design.xls等。,6.Internet资源的应用：目前已证实的siRNA序列,-,28,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的制备,1.化学合成siRNA是最贵的方法，但是却是最方便的许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成34对siRNAs的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究；不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。,-,29,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的制备,2.体外转录合成siRNA相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是能够更快的得到siRNAs。体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。,-,30,四、RNA干扰的研究方法,3.用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。这种方法制备一份混合有各种siRNAs“混合鸡尾酒”就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是200-1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA，然后用RNaseIII(orDicer)在体外消化，得到siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。,siRNA的制备,-,31,四、RNA干扰的研究方法,dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因，虽然现在多数的研究显示这种情况通常没有发生。最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗。,siRNA的制备,-,32,四、RNA干扰的研究方法,4.利用质粒或病毒载体表达siRNA多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III启动子(polIII)中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。包括的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNApolIII启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。使用这类载体，需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的polIII启动子下游。,siRNA的制备,-,33,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的制备,siRNA表达载体的构建,-,34,四、RNA干扰的研究方法,由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。不过幸好载体容易大量扩增，这个优点足以弥补所有缺陷，特别是当载体在实验中确实有效的时候。siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。,siRNA的制备,-,35,四、RNA干扰的研究方法,开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。适用于长期研究。不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。,siRNA的制备,除质粒载体外，科研人员已经成功地采用逆转录病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒载体将表达siRNA的DNA模板序列转移入哺乳动物细胞。现在许多学者正在加紧腺病毒载体的siRNA转移研究。,-,36,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的制备,5.PCR方法制备siRNA的表达框架siRNA表达框架(siRNAexpressioncassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto采用，包括一个RNApolIII启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNApolIII终止位点。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。,-,37,四、RNA干扰的研究方法,如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长期研究。主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制备。最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子；不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）。,siRNA的制备,-,38,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的制备,5种siRNA制备方法的比较,-,39,四、RNA干扰的研究方法,siRNA的制备,5种siRNA制备方法的比较,-,40,四、RNA干扰的研