米氏常数测定(精).ppt

实验十六底物浓度对酶促反应速度的影响米氏常数的测定目的要求（1）了解底物浓度对酶促反应的影响。（2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法,实验原理Km定义：Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。,Km的意义Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同。Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲和力大。测定Km值是酶学研究的一个重要方法。,米氏方程：VSv=Km+Sv:反应初速度（微摩尔浓度变化/min)V:最大反应速度（微摩尔浓度变化/min)S：底物浓度（mol/L)Km:米氏常数（mol/L)此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。,双倒数作图法测定Km值：1Km11vVSV,胰蛋白酶的性质,胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解，产生自由氨基端。,氨基的测定甲醛滴定法,CH2,NH2,HCHO,COO-,CH2,NHCH2OH,HCHO,COO-,CH2,NH(CH2OH)2,COO-,试剂和器材,1.1040g/L酪蛋白溶液（pH8.5）：四种不同S的酪蛋白标准溶液。2.中性甲醛溶液：75mL分析纯甲醛加15mL0.25%酚酞乙醇溶液，以0.1MNaOH滴至微红，密闭于玻璃瓶中。（自己配制）3.0.25%酚酞乙醇溶液：4.标准0.1MNaOH溶液。5.胰蛋白酶溶液（已配好）,试剂,器材：碱式滴定管,1取50mL三角瓶4个，加入5mL甲醛与1滴酚酞，以0.1M标准NaOH滴定至微红色，4个瓶颜色应当一致，编号。2量取40g/L酪蛋白50mL，加入一150mL三角瓶，37保温10分钟，同时胰蛋白酶液也在37保温10分钟，然后吸取5mL酶液加到酪蛋白液中。（同时计时！）充分混合后立即取出10mL反应液（定为0时样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（1号）加10滴酚酞；以0.1MNaOH滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，按耗去的NaOHmL数，每mL加一滴酚酞，再继续滴至终点，记下耗去的0.1M标准NaOHmL数。,操作方法,3在2分钟、4分钟、6分钟时，分别取出10mL反应液，加入2号、3号、4号小三角瓶，同上操作，记下耗去NaOHmL数。以滴定度（即耗去的NaOHmL数）对时间作图，得一直线，其斜率即初速度为V40（相对于40g/L的酪蛋白浓度）。然后分别量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。利用上述结果，以1/v对1/s作图，即求出V与Km值。,（1）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。（2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。,注意事项,思考题,试述底物浓度对酶