RT-qPCR技术的原理及应用ppt课件

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(RealtimeQuantitativePCR),实时荧光定量PCR定义,实时荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量PCR原理应用,绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)病原体检测转基因食品检测基因表达研究相对定量(RelativeQuantification，RQ)高通量基因检测方法的验证药物疗效考核耐药性研究,实时荧光定量PCR原理应用,中国人终末期肝病组织中乙肝病毒转录体的检测摘要目的:探讨肝组织中HBVDNA和病毒转录体与终末期肝病的关系.方法:用TRIzol从肝组织中提取组织核酸,PCR及RTPCR扩增HBVXDNA,XRNA,fRNA和trRNA,琼脂糖凝胶电泳显示产物,Southernblot杂交验证PCR扩增的可靠性.结果:27例HBsAg(+)肝组织,19例HBxDNA/RNA检测均为阳性,其中HBeAg(+)者fRNA检出率较HBeAg(-)者高;22例HBsAg(-)肝组织,有16例可检测到HBxDNA或RNA,HBsAg(-)的隐匿性感染在中国人终末期肝病中有较高的检出率72.7%;HBV病毒转录体trRNA在肝癌及肝硬化组织中的检出率明显高于其他肝脏疾病(P0.05).结论:HBV隐匿性感染与中国人终末期肝病的发生密切相关,肝组织中HBVtrRNA也与终末期肝病关系密切.,实时荧光定量PCR原理应用,实时荧光定量PCR原理应用,实时荧光定量PCR原理实时原理,常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,实时荧光定量PCR原理-Ct值的重现性,Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性,实时荧光定量PCR原理-定量原理,理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率,非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan,实时荧光定量PCR原理-DNA产物的荧光标记,实时荧光定量PCR方法1-SYBRGreen法,SYBRGreen,SYBRGreen法工作机理,SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位,SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBRGreen,实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理,SYBRGreen法融解曲线分析,SYBRGreen法-PCR反应的建立,反应体系的建立及优化:SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同,SYBRGreen法应用范围,起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。,实时荧光定量PCR法标准样品,相对定量中的内标内标通常是-actin、GAPDH、18SrRNA