三七种内遗传多样性的同工酶分析.doc

三七种内遗传多样性的同功酶分析肖慧1.2.3 ，崔秀明1.3*、（1云南省文山州三七研究院，云南，文山 663000；2. 云南药材有限公司，云南，昆明 650041;3. 云南省三七农业工程实验室,云南，文山 663000）摘要：采用同工酶标记对文山三七、广西三七、黄果三七、紫果三七及其近缘野生种屏边三七遗传多样性进行分析。结果表明：文山三七的PPB值（64.29）、Shannon值数（0.3058）、Neis基因多样性指数（0.1994）均为最高。AMOVA分析表明，有28.57% 的变异存在于种内，而有71.43%的变异存在于种间，即种间分化较大。各居群间的遗传距离变化范围从0.1312到1.1088，基因流变化范围从0.2到6.857。根据遗传距离进行UPGMA聚类分析，文山与广西三七亲缘关系较近聚在一起，黄果与紫果三七聚为一类，屏边三七单独聚类。关键字：三七；同功酶；遗传多样性中图分类号: 文献标识码: 三七Panax notoginseng(Burk)FHChen，亦称“田三七”、“山漆”、“田漆”，为五加科人参属多年生草本植物，主产于云南省文山州，为我国著名特产药材之一，享有“金不换”、“南国神草”等美誉。到目前为止, 已有学者在染色体观察、组织培养、表型变异类型、分子标记等方面开展了一些研究1-4，取得了一定的成果，但对三七的同功酶的遗传多样性分析方面的研究却未见报道。本文采用同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，以栽培三七为对象，从群体遗传学角度探讨不同材料的遗传变化，以期为三七的种质资源保护和利用及今后的育种工作提供基础资料提供理论依据。1. 材料和方法1.1实验材料随机选取文山三七20株，广西三七20株，黄果三七10株，紫果三七10株、屏边三七10株。每个植株随机取无病、正常生长的嫩叶12片置于4冰盒中，迅速带回实验室备用。黄果三七和紫果三七试验材料来源于文山州砚山县者腊试验基地，其余材料均来源于文山州三七研究所砚山试验基地。1.2实验方法1.2.1植物酶粗提液的提取 取面积约为12cm2大小的新鲜植物叶片，置于预冷的研钵中，加入35滴简单磷酸提取液，冰浴匀浆，倒入离心管中，编号，12000rm ，4离心10分钟，取上清液置冰箱保存，以供电泳分析。1.2.2 电泳1.2.3染色、固定、照相本实验共选取了13个酶系统进行检测，其中5个取得了较好的结果，分别是：过氧化物酶（POD）、酯酶（EST）、乙醇脱氢酶（ADH）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷氨酸脱氢酶（GDH）。（染色方法参照张维强，唐秀芝编著. 同工酶与植物遗传育种.1993）作者简介 肖慧（1980-）女，内蒙古人，硕士研究生*通讯作者 崔秀明（1963-），男，研究员，硕士生导师。主要从事中药材GAP研究。TelEmail:项目编号：国家“十一五”科技支撑项目（2006BAI06A12-13）；云南省自然科学资金项目（2007C136M）1.2.4 数据处理电泳图谱的每1条带记为1个位点，只记录那些可辩认的、两次扩增结果一致的条带。同一位点有带记为“1”，无带记为“0”，缺失记为“.”形成0/1矩阵图输入计算机，采用POPGENE1.32计算出三七各居群的Neis基因多样性指数（H）；Shannon信息指数（I）；多态位点百分比（PPB）；基因分化系数（Gst）；居群内基因多样度（Hs）；总的基因多样度（Hs）；总的基因多样度（Ht）；Neis遗传距离（D）遗传一致度（I）。用MEGA软件对各居群进行UPGMA聚类分析。2. 结果与分析图1.1 三七及其近缘种屏边三七酯酶图谱图1.3 三七及其近缘野生种屏边三七谷氨酸脱氢酶图谱2.1三七及其近缘种的遗传多样性分析通过对三七及其近缘种屏边三七6个同工酶的分析，共扩出40条条带，其中具多态性的有30条，占总数的75%。从表3.21可以看出，在三七居群内，文山三七的PPB值（64.29）、Shannon值数（0.3058）、Neis基因多样性指数（0.1994）均为最高；广西三七PPB值（21.43）、Shannon值数（0.0947）、Neis基因多样性指数（0.0586）在三七居群中是最低的。黄果三七和紫果三七之间PPB值相差较近10个百分点，而且黄果三七的PPB值、Shannon值数、Neis基因多样性指数均比紫果三七高，因此有更多的遗传多样性。三七的近缘种屏边三七的PPB值（25.64）、Shannon值数（0.1416）、Neis基因多样性指数（0.0944）仅次于广西居群，遗传变异不丰富。表1.1 三七及其近缘种的遗传变异Tabe1.1 Genetic variation of P.notoginseng and its related species居群Population总位点数Total number of loci多态位点数No. of polymorphic loci多态位点百分比PPB等位基因数na有效等位基因数neNeis基因多样性HShannon指数I文山三七广西三七黄果三七紫果三七屏边三七141314103993931064.2921.4342.863025.641.64291.21431.42861.21431.25641.32631.08291.24861.11521.15550.19940.05860.14710.070.09440.30580.09470.2220.1070.1416注：PPB =The percentage of polymorphic loci is；* na = Observed number of alleles；* ne = Effective number of alleles Kimura and Crow (1964)；* h = Neis (1973) gene diversity；* I = Shannons Information index Lewontin (1972)2.2三七及其近缘种遗传变异的分析根据遗传多样性水平在居群内（Ht）和居群间的分化（Ht-Hs）以及居群间遗传差异在总的遗传差异中所占的比例（Gst）（表1.2）可知，居群间遗传分化系数（Gst）达0.7143，这说明在种的水平上仅有28.57% 的分子变异存在于近缘种内，而有71.43%的变异存在于近缘种间，即近缘种间分化较大。而在种内，文山三七有18.99%的变异存在于居群间，而有81.01%的变异存在于居群内。在广西三七居群内，只有9.29%的变异存在于居群间，91.71%的变异存在于居群内。紫果三七居群间基因分化程度最高达71.43%，居群内基因多样性也最高，黄果三七的基因分化程度和居群内基因多样性最低。无论是种间还是近缘种间，居群内的基因多样性程度要小于总的基因多样性程度，这表明遗传变异主要存在于居群间。根据Wright（1931）当Nm*1时 ，基因流就可以防止由遗传漂变引起居群之间的遗传分化。从表1.2可知除紫果三七居群外，其余居群的Nm*都大于1，基因分化也低，每代迁入的有效个体数与群体间遗传差异水平成反比。表1.2不同居群间遗传分化分析Table1.2 Analysis of genetic differentiation among populations居群Population总基因多样性Ht居群内基因多样性Hs基因分化系数Gst居群每代迁移数Nm*文山三七居群标准差SD广西三七居群标准差SD黄果三七居群标准差SD紫果三七居群标准差SD屏边三七居群标准差SD0.0952 0.0265 0.0489 0.0154 0.2060 0.0422 0.0778 0.0296 0.0840 0.0226 0.07710.01830.04430.01320.19200.03730.02220.00490.05700.00970.18990.09290.06800.71430.32202.13304.88246.85710.20001.0526Ht= Total gene diversity； Hs= Gene diversity within population； Gst=The coefficient of gene differentiation； SD=Standard deviation； * Nm = estimate of gene flow from Gst or Gcs. E.g.， Nm = 0.5(1 - Gst)/Gst2.3三七及其近缘种遗传距离和聚类分析遗传距离分析表明（表1.3），各居群间的遗传距离在0.13121.1088之间，文山三七和广西三七的遗传距离平均为0.5041，黄果三七与紫果三七的遗传平均距离为0.5001，均表现遗传距离较近，在UPGMA聚类中，这四个居群也分别聚在了一起。而屏边三七与四个三七居群间有较大遗传分化，与其它四个居群分开，单独聚为一支（图1.1）。表1.3不同居群间的Neis遗传一致度（对角线上方）和遗传距离D（对角线下方）Table 1.3 Neis genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)pop文山广西屏边紫果 黄果文山广西屏边紫果黄果* 0.13121.10880.16250.15820.8770 *1.47750.47520.46850.330.2282*0.51830.61490.850.62180.5956*0.0120.85370.6260.54070.9881*文山广西黄果紫果屏边图1.1 三七及其近缘种间的UPGMA聚类图3.讨论3.1 三七及其近缘种的遗传多样性通过对三七及其近缘种屏边三七6个同工酶的分析得到的多态位点百分比在21.43到64.29之间。其中，文山三七的多态位点百分率（PPB）为64.29%，广西三七多态位点百分率（PPB）为21.43%，黄果三七多态位点百分率（PPB）为42.86% ，紫果三七（PPB）为30%，三七的近缘种屏边三七的PPB值为25.64%，仅次于广西三七。广西三七的多态位点百分率不足文山三七的三分之一，可能由于采样时间及三七的生长状况有关，在广西所采集的样本大部分三七的生长年限在3年以上，有些达到十几年，病虫害比较严重，从而出现偏差较大的现象。屏边三七多态位点百分比较低，可能由于检测样本的个体数太少，难以代表整个居群甚至整个物种的遗传多样性。3.2 三七及其近缘种的遗传分化通过对三七及其近缘种共5个居群的遗传变异的研究表明，遗传变异主要存在于居群间，居群内遗传分化较小。紫果三七的遗传分化系数达0.7143，与黄果三七相差近0.6，但其居群间基因分化系数低于黄果三七，这说明黄果三七与紫果三七遗传分化明显，遗传多样性丰富。3.3 三七及其近缘种的聚类分析三七与其近缘种屏边三七间的遗传分化较大， 同工酶所得的遗传距离较远。黄果三七、紫果三七和广西三七的遗传距离较近，文山与广西三七之间的遗传距离相对较远，但黄果三七与紫果三七聚为一类，文山三七与广西三七聚在一起（图1.1）。从同工酶所得的遗传距离可知，这四个居群间分别有着很亲密的亲缘关系，有着较高的遗传一致度。参考文献：1 段承俐等.文山三七栽培群体变异类型的分子鉴定.现代中药研究与实践，2003增刊2 ShiLiang ZHOU， LOSS of Genetic Diversity of Domesticated Panax notoginseng F.H Chen as Evidenced by ITS Sequence and AFLP Polymorphism：A Comparative Study with P. stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng. Journal of Integrative Plant Biology Formerly Acta Botanica Sinica 2005，47(1)：1071 153 孙玉琴等，三七植株性状差异观察. 现代中药研究与实践，2003增刊4 李一果，云南文山三七栽培群体遗传变异类型和遗传背景研究，云南农业大学学位论文，20045 张维强，唐秀芝编著. 同工酶于植物遗传育种. 北京：北京农业大学出版社. 1993.12.167-1906 Wright，S.， Evloution in Mendelian PolutationJ. 1931， Genetics 16:97-159Solbring，O.T (ed) 1991. From Genges to Ecosstems A Research Agenda for Biodiversity Paris：IUBSGenetic Diversity in Panax notoginseng Using Isozyme MarkersXIAO HUI 1.2.3,CUI XIU-MING1.3*(1. Wenshan SanQI Research Institute, Yunnan Wenshan 663000;2. Yunnan herbs ltd,Yunnan Kunming 650041;3. SanQi Agricultural Engineering Laboratory of Yunnan Province, Yunnan Wenshan 663000)Abstract: Genetic diversity among the Wenshan Sanqi、 Guangxi Sanqi 、Huangguo Sanqi 、Ziguo Sanqi and their w