小分子肝素的制备

,小分子肝素的制备,陈紫娟,目录,概述,1,制备方法,2,酶活测定方法及分子量测定方法,3,实验进度及问题,4,1概述,肝素（Unfractionatedheparin,UFH）作为抗凝剂和抗血栓药在临床上使用已有60余年，但长期使用会导致出血和血小板减少等不良现象。低分子肝素(Low-molecular-weightheparin,LMWH)是由普通肝素裂解而来。与普通肝素比较，其抗血栓能力较强而抗凝血能力较低，在其抗血栓能力形成时对凝血系统的影响较小。另外低分子肝素还具有分子量小、生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小等特点，因此低分子肝素的制备具有重要的意义。,根据其末端链的差异和制备方法的不同，低分子肝素主要分为八种。,2制备方法,化学裂解法亚硝酸降解法、过氧化氢降解法、-消除降解法和其它化学降解法,制备方法,物理分离法有机溶剂分级沉淀法、凝胶色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法和超滤法（不适用与工业化生产）,酶解法肝素酶,2.1.1亚硝酸降解法肝素钠溶液降解液中和液沉淀低分子肝素,2.1化学降解法,1%醋酸,PH2.3-3.0,亚硝酸钠,-530，3.5h,氢氧化钠中和,PH6.5-7.0,无水乙醇,丙酮脱水，干燥,该解聚肝素的过程受温度、溶液pH值、亚硝酸盐的浓度及降解时间的影响较大。,2.1化学降解法,2.1.2过氧化氢降解法肝素钠溶液溶液反应液浓缩液中和液沉淀低分子肝素该法制备LMWH的过程也主要受反应的温度、pH值和过氧化氢浓度的影响,乙酸钠,PH7.8,抗坏血酸、乙酸铜水溶液,PH7.8,边搅拌边加入过氧化氢,PH7.8，40，24h,真空浓缩,EDTA钠盐,PH6.5-6.7,无水甲醇,干燥,2.1化学降解法,2.1.3-消去降解法-消除降解法包括肝素季铵化和降解两步处理。肝素的季铵盐和卤代烃或卤代苄基化合物在二氯甲烷或二甲基甲酰胺中可以发生酯化反应,生成的肝素酯可在碱性条件下水解成LMWH。肝素解聚程度可由酯化率，碱性条件或酯的类型决定。2.1.4其它化学降解法除亚硝酸降解、-消除降解法和过氧化氢降解这三种工业上用来制备LMWH的化学方法以外，还可采用高碘酸降解、次氯酸降解、-照射和硫酸一氯磺酸降解等几种方法制备LMWH。这几种制备方法目前没有其投入工业化生产的报道。,2.1化学降解法,优点：化学裂解法工艺简单，成本低廉，适宜工业化生产。缺点：化学裂解法在裂解过程中容易导致硫酸基丢失ATlll一结合部位减少，同时其在裂解过程中易引入有毒物污染环境。,2.2酶解法,肝素的酶法降解己经被用作分析肝素的结构和制备LMWH。肝素酶是能特异性的裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌（Flavobacteriumheparinum）中发现并分离。后在一些其它的微生物和真核生物中也有发现，如拟杆菌属、棒杆菌属和芽孢杆菌属等几种，真核生物的霉菌、胎盘、胸腺、血小板等中均有发现。肝素酶主要用于低分子肝素生产和链上精确结构的研究，现在市场上肝素酶价格昂贵且都是肝素黄杆菌肝素酶，这是由于分离肝素酶稳定性差及产量不高所造成的。,2.2酶解法,相较化学裂解法，酶解法裂解环境温和、对环境无污染，但目前市场上售卖肝素酶，价格昂贵，且均是肝素黄杆菌肝素酶。为了降低肝素酶的价格，可尝试以下三条途径：,筛选新的高效产酶菌株,生化方法,进一步研究肝素酶的结构、性质，提高分离纯化效率。,3低分子的测活方法及分子量的测定,天青A法,血浆凝固法,生色底物法,可以测定低分子肝素含量但却无法反应LMWH的抗Xa因子和抗IIa因子活性，因为失活的肝素同AzureA仍可显色,证明现有理化方法测得的肝素化学等效性并非生物等效性。,凝固法用血浆做底物,血浆存在较大的差异,本身就可带入试剂误差;用人眼观察凝块出现时间,造成人为误差;采用标准曲线计算效价,也存有统计误差。,它在效价测定中的特异性,分光光度法的使用使常规测定自动化、标准化。,3.1酶活测定,3.1低分子的测活方法,活性测定时不能简单的套用理化法的实验设计标准曲线法,而应采用生物测定的量反应平行线法,而生物测定的实验误差比理化测定大,有各种无法控制的随机因素所引起的差异，在检测LMWH效价时可尝试结合理化测定方法和生物测定方法。,3.2低分子肝素的分子量测定,用于LMWH分子量测定的方法有粘度法、低压排阻色谱法、高效排阻色谱法(HPEC)、超速离心法、光散射法、梯度聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)法等。,4实验进度及问题,4.1拟完成的内容：（1）比较几种测定低分子肝素活性的方法（天青A、血浆凝固法、生色底物法），建立测活有效方案。（2）探索制备低分子肝素的最佳方案。（3）试图筛选新的产肝素酶的微生物、优化发酵条件并分离纯化该肝素酶。,4.2已完成的内容,已完成内容：（1）筛选到两株产肝素酶的菌株并制得粗酶液（2）对影响天青A测酶活方法的因素（测活时间、pH、离子浓度、金属离子、一些化学物质）进行了研究。,4.3目前遇到的困难及解决问题方案,（1）在天青A测酶活的过程中，发现离子强度对该法测酶活的稳定性影响较大，易出现假阳性现象。另外该法在建立标曲的时，线性关系不是很好。鉴于天青A法测得的肝素化学等效性并非生物等效性，拟采用药典上的血浆凝固法和生色底物法测酶