第七章外源化学物致突变作用

.,第七章外源化学物致突变作用,.,案例3分析讨论,镰刀型细胞贫血是遗传物质DNA中血红蛋白基因序列中一个CTT变成CAT，即发生基因颠换，血红蛋白链中N端第六位氨基酸由Glu变为Val，血红蛋白分子发生遗传缺陷，以至产生病变。这种疾病可以遗传。通过这个案例，一方面了解从碱基改变，到编码产物的改变，再到表现型的改变最后到健康效应的出现之间的因果关系。另一方面要认识到基因突变的发生会引起严重的健康危害。,.,第四节机体对致突变作用的影响,.,遗传物质在外源性因素的损伤仍能代代相传的原因：,DNA可执行高保真度的复制，对复制中的错误能及时修复，从而达到高度的保真。细胞能够通过对DNA损伤的修复而保护亲代DNA链，使之避免由于内、外各种因素的损伤而发生改变。,.,一、DNA损伤的修复,（一）直接修复：依赖酶的作用。光复活：依赖光的过程，通过光裂合酶切下DNA上嘧啶二聚体，将毗连的嘧啶接回原结构上。可以完全修复紫外线诱发的嘧啶二聚体，使其在原位上恢复为单体。“适应性”反应：通过烷基转移酶修复DNA烷化损伤，保护细胞免受烷化剂的毒性影响。,.,（二）碱基切除修复,DNA糖基酶作用于受损的DNA，识别并切除损伤碱基，通过切断碱基与脱氧核糖连接的键，使受损的碱基脱落，留下一个无嘌呤或无嘧啶的AP位点。AP内切酶将DNA链切断，由聚合酶和连接酶完成修复过程。碱基切除修复是细胞对碱基氧化损伤的主要防御系统。,.,（三）核苷酸切除修复使细胞具有从DNA上移除较大损伤。所有生物体最常见的修复机制。基本可以修复所有种类的DNA损伤。过程：内切酶，损伤识别；损伤两侧切除损伤链；切除寡聚核苷酸；修复合成填补产生的缺口；DNA连接酶封闭，恢复原有DNA序列。,.,（四）双链断裂修复,未修复的双链断裂启动DNA损伤反应系统，使细胞阻滞于周期的某一期或诱发细胞凋亡。不是修复，是一种耐受过程，以容忍损伤继续存在和高突变率情况来换取细胞继续生存的耐受过程。,.,（五）交联修复：当细胞内发生DNA链内交联，会造成双链的断裂，机体启动无误交联修复或易误交联修复。,.,小结,修复的结果不全是有益的。修复的途径是多种。修复与突变不可分。损伤修复突变,.,二、遗传因素对致突变作用的影响,（一）代谢酶遗传多态性1、氧化代谢酶芳烃羟化酶：催化多环芳烃等致癌物活化。2、酯酶环氧水化酶：活化酶，参与苯并（a）比代谢为终致癌物。3、谷胱甘肽硫转移酶缺乏易患肺癌,.,（二）修复功能的个体差异,修复酶的多态性造成机体对损伤的反应不一。1、O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶：功能：恢复碱基的原有配对性。缺乏或活性降低：肿瘤发生2、聚（二磷酸腺苷核糖）多聚酶：功能：氧化损伤的修复方式，对外来因素造成基因突变和肿瘤发生可产生抑制或促进作用。,.,小结,遗传因素是化学毒物的作用靶部位，是决定化学毒物毒作用性质和强度的一个重要因素。遗传因素对致突变作用的影响的研究，是预防和治疗肿瘤的新思路。,.,第五节观察外源化学物致突变作用的基本方法*,.,致突变试验的应用,中国预防医学博士张学明:煎炸鱼中合有强致癌物杂环胺。杂环胺的形成量主要受煎炸、烤的温度影响，其次是煎烤时间。煎炸温度小于200，杂环胺的形成量就很少；如果煎炸温度超过200，煎炸时间少于2分钟，杂环胺的形成量也很少；在煎炸的鱼外面挂上一层淀粉糊再炸，也能预防杂环胺形成。美国加州科研人员发现，高温烹调或油炸的肉食中合有突变源，对经过高温烹调的牛肉、鸡、鱼等进行检验，结果测出10种致癌化合物，这次研究证实，突变源不是由于炭火等热源将肉烧糊所致，而是肉食本身成分在加温200以上时的产物。,.,检测化学物的致突变性的目的：,鉴定生殖细胞和体细胞的致突变物；预测潜在致癌物环境致突变物的监测与评价。,.,一.观察项目的选择（一）观察的效应终点类型遗传学终点(geneticendpoint)：基因突变和染色体畸变的检测可直接反映外源化学物的致突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠的方法。有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变,染色体畸变和染色体分离异常,而仅反映致突变过程中发生的其他事件。因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点。包括：基因突变，染色体畸变，染色体组畸变，DNA原始损伤,.,（二）成套观察项目1.原则选择的遗传毒性试验应包括每一类型的遗传学终点。应包括多种进化程度不同的物种,如原核细胞,低等和高等真核细胞。体内试验与体外试验配合。,.,2.HIC(1997)对于药品的遗传毒性评价建议的实验组合为：,细菌基因突变试验体外哺乳动物细胞染色体畸变实验或体外小鼠淋巴瘤细胞tk试验；体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验；对标准致突变实验组合的结果进一步研究时，可以选择其他一些实验，如DNA加合物测定、DNA链断裂检测、DNA修复实验等。,.,二、常用的致突变试验细菌回复突变试验微核试验染色体畸变分析姐妹染色单体交换试验果蝇伴性隐性致死试验显性致死试验程序外DNA合成试验单细胞凝胶电泳,.,(一)细菌回复突变试验Ames试验*,是利用突变体的测试菌株，观察受试物能否纠正或补偿突变体所携带的突变改变，判断其突变型。,常用的指示菌株：鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌。,广泛应用鼠伤寒沙门菌突变试验。,.,(一)细菌回复突变试验Ames试验*1.原理：是人工诱变的突变株在组氨酸操纵子中有一个突变，突变的菌株必需依赖外源性的组氨酸才能生长，而在无组氨酸的选择性培养基上不能存活。致突变物可使其基因发生回复突变，使它在缺乏组氨酸的培养基上也能生长。计算诱发的回复菌落数即可判断化学毒物的致突变性。,.,2.常用菌株：鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型突变株为指示微生物。目前推荐使用TA100TA102TA97TA98为增强对诱变物的敏感性加入一些附加突变：,试验中可供选用的测试菌株有多种，所携带的突变在不同的基因中，各有不同的特征，有的测定碱基置换，有的测定移码突变，有的两者都可测定，根据实验目的配套选择。,.,(一)Ames试验3.方法：点试法：用作定性试验，适用于短期大量筛选,.,平板掺入法：标准试验，用作定量测定,.,(二)微核试验(micronucleustest,MNT)观察受试物产生微核发生率或有微核的细胞率为观察指标检测化学物染色体损害能力的试验，DNA断裂剂，非整倍体诱变剂。微核（micronucleus）：染色体或染色单体的无着丝点断片或因纺锤体受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂的后期仍留在子细胞的胞质内，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，比主核小。,.,正常细胞、微核细胞,.,正常细胞、微核细胞和核异常细胞,指示正常细胞；指示微核细胞；指示核异常细胞（2.5100）,.,骨髓多染红细胞微核试验,大多数类型的细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起难以鉴别。常规：骨髓多染红细胞微核试验多染红细胞是成红细胞发展为成熟红细胞时，主核已排出，微核仍保留在细胞质中，成为多染红细胞（polychromaticerythrocytesPCE）,这些细胞保持其嗜碱性约24小时，然后成为正染红细胞，并进入外周血。计数骨髓有微核多染红细胞率可判断受试物对骨髓细胞的染色体损伤作用。,.,骨髓细胞微核试验的不足,某些化学物在骨髓难以达到有效浓度。骨髓中的SCE是动态平衡，其不断成熟为红细胞，红细胞又衰老死亡。化学物毒物主要在肝脏活化，其活化中间产物可能在到达骨髓之前消失。仅观察体细胞其结果外推其他组织应慎重。,.,微核实验进展,体外微核试验：中国仓鼠肺细胞/中国仓鼠卵巢细胞/中国仓鼠成纤维细胞，易于操作和控制受试物浓度。外周血微核实验：可能成为人群观察化学毒物遗传毒性的一种手段。双核细胞法：提高微核的灵敏度。免疫荧光染色法、荧光原位杂交：灵敏度高，还可判断来源（断片还是染色体）。,.,(三)染色体畸变分析chromosomeaberrationassay,观察染色体形态结构和数目改变，又称细胞遗传学试验。观察：用显微镜检查细胞分裂中期相染色体畸变和染色体分离异常。结果：裂隙，断裂，断片，微小体，染色体环等。,.,常染色体异常,Downsyndrome(trisomy21):先天愚型或唐氏综合征,.,三体综合征（13三体）：严重的眼，脑，循环系统缺陷以及腭裂。儿童生活很少超过几个月。,.,(四)姐妹染色单体交换试验(sister-chromatidexchange,SCE)指染色体同源座位上DNA复制产物的相互交换,其频率与DNA断裂和修复有关。检测DNA损伤的灵敏指标。,原理：在细胞培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶（5-BrdU，嘧啶类似物），在DNA合成期可与胸苷竞争掺入DNA中，经两个分裂周期后，两条染色单体，其中一条DNA链的双链内T被5-溴脱氧尿嘧啶核苷取代，另一条只有一条链被取代。用染色剂处理，使双链含BrdU的染色单体着色浅淡，单链含BrdU的染色单体着色深。当姐妹染色单体间发生同源片段交换时，就可以根据每条染色单体夹杂着深浅不一的着色片段加以区分。,.,(五)果蝇伴性隐性致死试验,原理根据隐性基因在伴性遗传中的交叉遗传特征，即雄蝇的X染色体传给F1代雌蝇。又通过F1代传给F2代雄蝇。位于X染色体上的隐性基因能在半合子雄蝇中表现出来。据此推断致死突变的存在。结果：能检出点突变，小缺失，重排。,优点：判断突变终点客观、不需活化。不足：与哺乳动物差异较大。,.,(六)显性致死试验1.原理对雄性动物染毒，观察一个精子发育周期中各个阶段雌鼠出现受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡。致突变物引起哺乳动物生殖细胞染色体发生结构和数目变化。2.检测整体哺乳动物生殖细胞遗传性（染色体畸变）损伤的方法。是评价化学毒物对雄性动物的生殖细胞遗传毒性较好的方法之一。,不足：灵敏度差，动物数量大，一定的受孕率。,.,（七）程序外DNA合成试验(unscheduleDNAsynthesis，UDS),当DNA受损伤时，损伤修复的DNA合成主要在S期以外的其他细胞周期，称程序外DNA合成*。原理：观察分离或培养的细胞，加入标记DNA合成原料，如3H-胸苷，测定S期以外3H-胸苷掺入胞核的量，判断受试物是否造成DNA损伤。因此发现UDS增高，即表明DNA发生过损伤。,.,39,(八)单细胞凝胶电泳试验(singlecellgelelectrophoresis，SCGE)（彗星试验(cometassay)）,一种快速检测哺乳动物细胞DNA损伤的实验方法。原理：DNA损伤后，断裂的DNA片段比大片段DNA迁移的更快，电泳后出现彗星状，即可判断DNA损伤。,.,几种遗传毒理学试验的哺乳动物性细胞致突变物筛检可靠性评价,试验灵敏性(%)特异性(%)准确性()Ames试验17/19(89%)3/10(30%)20/29(69%)骨髓细胞染色体畸18/18(100%)2/10(20%)20/28(71%)变试验或微核试验显性致死试验18/18(100%)8/10(80%)26/28(93%),.,常用的遗传毒理学试验的特点,.,（九）观察方法的新进展（自学）1.转基因小鼠致突变检测系统2.微核自动化检测技术3.荧光原位杂交技术,.,致突变试验的应用实例如何设计？,分组（化合物）选择致突变实验组合体外，体内观察遗传学终点做出评价,.,致突变实验的应用实例,.,.,.,致突变实验的应用实例空气污染,家庭装潢有害气体致小鼠遗传毒性实验,.,三、致突变试验中的一些问题,（一）阴性和阳性对照的设立阴性对照为了获取试验的基础数据。阳性对照证明试验方法的可靠；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本试验的重复性。,.,(二)体外试验的活化系统1哺乳动物细胞介导使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。特点：这也是一种活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9。不足：但不如体内活化系统。,.,2S9S9指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。特点：它主要含有混合功能氧化酶(MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统。缺点：S9随实验动物种属或器官不同而有差异；S9含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。,.,3纯化酶和基因工程纯化酶：应用纯化细胞色素P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。基因工程：将人的细胞色素P-450基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢活化系统。不足：不可能完全取代整体动物代谢。,.,（三）致突变试验与致癌试验的关系已知致突变作用是致癌机制之一。利用致突变试验预测致癌性时，应该考虑敏感度与特异性。通过互补复合试验加以克服。致突变试验仅可检出遗传毒性致癌物。,.,（四）试验结果在毒理学安全性评价中的作用,1.实验的质量控制：盲法观察；阴性对照和阳性对照的设立；资料的统计学分析；试验结果的重现性。2.阴性结果判定条件：最高剂量应包括受试