激光扫描共聚焦显微镜ppt课件

.,激光扫描共聚焦显微镜在微生物研究中的应用刘盛荣2011-09-09,.,.,CTC染色,BaclightLive/Dead染色,BaclightLive/Dead染色,激光扫描共聚焦显微成像,.,主要内容,1、分子荧光的形成2、微生物研究中常用的荧光染料3、共聚焦显微镜基本原理4、共聚焦显微镜在微生物研究中的应用,.,一、分子荧光的产生,1.1分子荧光产生的条件1.基态分子受到能量激发，吸收一定能量后，跃迁至激发态,通常为*、n*跃迁2.激发态分子在很短时间内，以电磁辐射的形式释放能量并返回基态，便产生了分子发光（荧光或磷光）,.,.,1.2影响荧光的因素1.溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加3.溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制,.,二、微生物研究中常用的荧光探针,荧光探针主要基于测定微生物的某一生理进行分类,.,1、膜通透性（membraneintegrity）2、代谢活性(metabolicactivity)3、膜电位(membranepotential)4、酯酶活性(esteraseactivity)5、pH梯度(pHgradient)6、其它,微生物研究中主要的荧光探针：,.,1、膜通透性(membraneintegrity)BacLightLive/Dead(PI/SYTO9),PI,PI,PI,PI,PI,PI,SYTO9,SYTO9,SYTO9,PI,PI,PI,PI,PI,Viablecell,Damagedcell,SYTO9,SYTO9,.,链霉菌不同发酵时期：菌丝活性及内部结构,Example1.StainingofStreptomycessp.withBacLightlive/deadL7007,.,2、代谢活性(metabolicactivity),微生物代谢活性分析的荧光探针主要有：5-Cyano-2.3-ditolyltetrazoliumchloride(CTC)3-(4,5-Dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2-tetrazoliumbromide(MTT)2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumbromide(INT),.,红色荧光分子,无色非荧光分子,Viablecell,CTC的微生物细胞还原,CTC,CTF,CTF,.,Example2:StainingofStreptomycessp.withCTC,CTC染色,CTC染色,.,3、酯酶活性(esteraseactivity),工作原理：在活性微生物细胞酯酶作用下，将非荧光分子水解，释放出荧光分子并依靠膜的完整性保留于胞内1.Fluoresceindiacetate(FDA)2.5(6)-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester(CFDA-SE),.,荧光染料作为底物由酯酶所水解产产生荧光分子,活性微生物细胞,活性微生物细胞将其还原为荧光分子并沉淀于微生物细胞内,.,4、膜电位（membranepotential）,工作原理：活性微生物细胞可维持细胞的膜电位，可作为微生物细胞活性的一个评价的生理指标1.带正电荷荧光探针Rhodamine123(Rh123);DiOC6(3)进入活性细胞2.带负电荷荧光探针Bis-(1,3-dibutylbarbituricacid)-trimethineoxonolDiBAC4(3)进入死细胞,.,5、pH荧光探针,工作原理：活性细胞可以维持胞内外一个合适的pH梯度，因此，测定微生物细胞内的pH可作为细胞生理状态的一个评价标准1.5(6)-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester(CFDA-SE)2.Pranine3.BCECF,.,一些常见荧光染料的激发与发射波长,.,三、激光扫描共聚焦显微镜,3.1激光扫描共聚焦显微镜的组成显微镜光学系统扫描装置激光光源检测系统整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。,.,3.2共聚焦成像原理,.,.,MoreColorPossibilities,2.LessCrossTalk（串色）,3.3激光扫描共聚焦显微镜与荧光显微镜比较,.,4.Three-DimensionalReconstructionofSpecimen（三维重构）,5.ImprovedResolution（更高的分辨率）,3.OpticalSectioningofObjectsWithoutPhysicalContact（光学切片）,.,.,Example3:Comparisonofconfocalmicroscopywithfluorescentmicroscopy,Fluorescentmicroscopy,Fluorescentmicroscopy,Confocalmicroscopy,显示的是一个光学切面,.,样品的3D-重建,.,激光扫描共聚焦显微镜主要功能,1、荧光定性2、荧光定量3、动态荧光监测4、断层扫描5、三维重构6、共聚焦图像分析7、荧光显微切割,.,四、激光扫描共聚焦显微镜在微生物研究中的应用,4.1共聚焦在链霉菌研究中的应用1、发育分化的研究2、内部结构及活性研究3、菌体大小测量4、产物合成的研究,.,链霉菌Streptomycesantibioticus的生长分化,.,4.2共聚焦在真菌研究中的应用1、真菌浸染机制的研究2、真菌发育分化的研究3、真菌生长的研究4、真菌活性的研究（FDA/PI）5、真菌的原位研究6、真菌细胞融合的研究7、一些机制的研究，如胞吞等,.,4.3微生物的群落分析1、环境中微生物的分布及活性的原位分析（光学切片功能）2、食品污染分析,.,1、荧光原位杂交研究（Insituhybridization）2、生物膜的研究(bioflim)3、细菌在植物根部的定植研究4、细菌的活性分析5、抗菌分析,4.4共聚焦显微镜的其它相关的研究,.,实验：激光扫描共聚焦显微基本步骤,1、选择荧光探针：主要