第六章常用分子生物学技术的原理及应用

第六章,常用分子生物学技术的原理及应用Thepopulartechnologyinmolecularbiology:principleandapplication,第一节分子生物学发展概述,分子生物学molecularbiology是在分子水平上研究生物的结构、组织和功能的科学。1950年，Astbury在一次学术报告中，首次提出并使用了分子生物学这一名词术语。医学分子生物学是应用分子生物学技术和理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及其调控的分子机理的一门科学。,概述,一、分子生物学一些重要的理论知识,1.分子生物学发展史上一些重要的事件（1）1865年，“遗传学之父”G.Mendel根据豌豆杂交试验结果，创立了遗传因子学说，即遗传的分离律和自由组合律。（2）1903年W.Sutton提出染色体是Mendel遗传单位的载体的概念。（3）1909年，W.Johannsen将这种在染色体上的遗传单位定名为基因（gene）。,（4）1910年，现代实验遗传学奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗传规律时发现了基因的连锁律和交换律。（5）1944年，OT.Avery等人（3人）分离出细菌DNA，并发现DNA是携带生命遗传物质的分子。（6）1950年，Astbury在一次演讲中，首次使用了“分子生物学”术语。,（7）1953年，Watson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复制的机制。（8）1961年至1966年，Nirenberg和Crick等人破译了DNA遗传密码，1966年破译了64个遗传密码。提出了遗传信息由DNARNA蛋白质传递的中心法则。（9）1969年，JonathanBeckwith及其同事在哈佛大学成功分离出第一个基因。,（10）1961年，F.Jacob和J.Monod提出了乳糖操纵子学说。（11）1970年，发现了逆转录酶。（12）自1946年起的20年当中，陆续发现了许多质粒；1968年至1970年又发现了许多限制性内切酶，为DNA体外重组提供了有利工具。（13）1973年，重组DNA技术问世。（14）1986年，K.Mullis等建立了PCR技术（15）1990年，人类基因组计划。,DNA的结构、复制、中心法则基本构成单位是核苷酸核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸构成。碱基分别是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键相连进一步盘旋、折叠，形成三级或四级结构,2.一些重要理论importanttheory,五碳糖为核糖(不是脱氧核糖)；碱基中有尿嘧啶U(uracil)而没有胸腺嘧啶RNA为单链，不是双链，但RNA单链之间相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链。DNA存在于细胞核的染色体、线粒体以及染色体以外的质粒中(质粒是一些双链，闭环的DNA分子)。,RNA与DNA有如下不同点：,DNA(或RNA)结构给我们的启示DNA(或RNA)是水溶性的。这是由于含有磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提取过程中，我们保留的是水相、而不是有机相。核酸是两性电离，既带正电荷，又带负电荷。它的等电点(PI)为22.5。在中性溶液中带负电荷。对核酸进行电泳时，点样时应点在负极；杂交时选择尼龙膜时，最好选择带正电荷的尼龙膜。(核酸带负电荷，容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉),DNA在细胞中存在部位不同(细胞核、线粒体、质粒)，所以应注意提取方法的不同由于DNA空间构象不同，在电泳时迁移率不同。根据碱基互补配对原则，可设计引物和探针杂交。由于DNA的双螺旋结构和RNA易由于分子内氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等反应时，首先应加热变性，破坏二级结构。,在解旋酶的作用下，打开DNA双链在特定的复制起始点以每条DNA链为模板在DNA聚合酶的催化下以4种脱氧核苷酸为前体物，合成一条互补DNA链。DNA的复制称为半保留复制。,DNA的复制,DNA半不连续复制,PCR技术的原理：在体外要靠温度(90以上)打双链，而不是解旋酶，也是以DNA为模板，需要引物，需DNA聚合酶，需要dNTP为前体。PCR与体内(细胞内)DNA复制的最大差异是温度。检测核分裂指数：在细胞培养中，加入3H标记的dNTP前体物，被细胞摄取后，参与DNA复制，复制速度越快，参入的3H标记的dNTP越多，可用液闪计数仪检测放射性强度，据此判断。,DNA的复制给了我们一些启示,遗传信息的传递是：DNARNA多肽(蛋白质)在逆转录酶的作用下，RNA可形成cDNA，然后再由RNA蛋白质以上就是完整的中心法则理论，亦可称为基因的表达(expression)。,中心法则,中心法则,反义链,转录(transcription),反义链,有意义链,转录(transcription)以DNA为模板，合成RNA的过程。非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链。转录的过程大致是这样的：以DNA一条链为模板，诱导RNA聚合酶活性、RNA聚合酶识别并结合在转录起始位点以ATP、GTP、CTP和UTP为前体，合成(转录)RNA当遇到转录终止信号时，转录即停止。,由RNA蛋白质的过程，又叫翻译。只有聚合酶II催化的反应产物是mRNA，而只有mRNA才翻译成蛋白质。基因(DNA)上三个相邻的碱基组成一个密码子，一个密码子决定一种特定的氨基酸，共有43=64个密码子。在转录过程中，基因上的三联密码子转录成mRNA上的三联密码子。mRNA由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以三联密码子指导合成蛋白质。翻译后的蛋白质需要加工修饰。,中心法则给了我们一些启示：,遗传信息由DNA上的基因决定。一旦基因发生突变，将最终导致所翻译的蛋白质发生改变，从而导致生理功能改变，甚至出现疾病，如癌症、肥胖等。mRNA更能准确简便地反映DNA上基因所携带的遗传信息。因此对基因序列的分析，常分析mRNA的序列即可。,基因的表达有组织特异性，且受许多因素的影响，使mRNA的表达增强、降低甚至关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至出现疾病。因此常需要检测mRNA的表达的丰度(含量)，常用方法有Northernblot、RT-PCR。定量(Realtime)PCR等。这里需要特别强调：在检测mRNA(或蛋白)表达时，一定要先弄清该基因在某种组织中是否有表达。,根据中心法则，可以RNA为模板，在逆转录酶作用下形成cDNA，于是建立了RT-PCR的方法。根据mRNA的3端有poly(A)的特点，在进行反转录时，就以poly(A)为模板设计了引物。并且纯化mRNA的方法，也是根据poly(A)的原理设计的。根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建立不同的蛋白质提取方法，如在线粒体，在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。,第二节常用分子生物学技术,MolecularCloningVectorsplasmidphagecDNAgenomiclibrariescDNAlibrariesDNAligationRecombinantDNAmoleculesTransformationSelectionchromosomewalkingmolecularhybridizationDNAsequencing,Thepolymerasechainreaction(PCR)inversePCRreversetranscriptasePCRQuantitativePCRasymmetricPCRRNAiMultiplexPCRSouthernBlottingDNAngerprintingWesternblottingNorthernblottingArbitraryprimerPCRfluorescenceinsituhybridization(FISH)GenechiporDNAchip,本章常用技术词汇,一基因工程与分子克隆(geneticengineeringandmolecularcloning),Researchcontent:genomiclibrary,cDNAlibrary,genecloning,geneexpression,generegulation,geneknockout一、用于基因克隆的工具酶(enzymesforgenecloning)在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。,由宿主控制的限制与修饰作用使得细菌避免噬菌体感染，如果噬菌体DNA没有被修饰过，进入宿主就会被限制性酶切断。如果被修饰过，其侵染细菌的效率就提高。,限制性内切酶及由宿主控制的限制与修饰作用,二、分子克隆(MolecularCloning),1.Vectors,Vectors:ADNA(aplasmidoraphageDNA)thatservesasacarrieringenecloningexperiments.,质粒载体必须具备的基本条件,(i)具有复制起点(ii)具有可选择的标记(iii)具有若干限制酶单一识别位点(iv)具有较小的分子量和较高的拷贝数(v)作为表达载体还有启动子，转录、翻译信号，终止子序列等片段。,lacZ,Thestructionofplasmid,screencloning,噬菌体载体：,Charon系列，分为取代型和插入型：取代型可接受20kb左右的外源DNA，适合于构建基因组文库。插入型只可接受10kb以内的外源DNA，适合于构建cDNA文库。,（1）人工合成（一般限于数十个核苷酸的片段）其原理是在测定肽链或蛋白顺序的基础上，根据遗传密码推测mRNA序列和DNA序列，经严格设计、以化学法合成DNA。生长激素释放抑制因子、胰岛素、干扰素表皮生长因子等基因都曾以这样的方法合成，这种合成还可分段进行，继后再连接。但这类方法很难考虑遗传密码简并以及内含子的存在等问题。,2、目标基因的获得,(2)逆转录法合成cDNA第一、二条链,三、基因组DNA文库,目录,四、染色体步移,是以不同个体或不同细胞来源的基因组片段（包括mRNA-cDNA、cDNA-cDNA、DNA-DNA）之间，在一定条件下变性、复性。一旦某一个体细胞缺失了某一DNA片段或某mRNA不正常表达，在与正常来源的DNA片段或正常表达mRNA的cDNA进行DNA-DNA，cDNA-mRNA或cDNA-DNA杂交时，未缺失的特定DNA片段或正常表达的mRNA逆转录而合成的cDNA片段就会因没有与其同源的互补顺序而不形成杂交体，从而出现部分单链。通过某种方法，将形成杂交双链的片段排除（消减），未形成完整杂交体的DNA或cDNA片段分离出来，即可得到相应的片段或探针。,五、消减杂交,一个标准的克隆外源片段过程,植物转基因抗虫棉,动物转基因生物反应器,二分子杂交与印迹技术Molecularhybridization&blottingtechnology,核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可在不同的分子之间形成杂化双链的这种现象。,一、分子杂交与印迹技术的原理,杂交的原理实质是核酸分子的变性与复性过程,复性,RNA,DNA,（一）印迹技术,1.具体步骤SouthernE1975年首次应用,SouthernEM.DetectionofspecificsequencesamongDNAfragmentsseparatedbygelelectrophoresis.JMolBiol，1975,98(3):503-517.,原始文献出处：,（一）印迹技术,1.具体步骤SouthernE1975年首次应用,琼脂糖分离的DNA片段变性为单链将一张NC膜放在胶上，上面放吸水纸巾利用毛细作用使胶中的DNA片段转移到NC膜上，使之成为固相化分子。,载有DNA单链分子的NC膜可在杂交液与另一种DNA或RNA分子（探针）杂交，具有互补序列的RNA或DNA结合到存在于NC膜的DNA分子上，经检测分析可显现出杂交分子的区带。,2.印迹(blotting)定义,将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分析的技术。,3.应用,广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测,4.发展,电转移印迹技术、真空吸引转移印迹等,（二）探针技术,探针(probe)的概念,用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA片段或RNA片段,探针的种类,寡核苷酸探针基因组DNA探针cDNA探针RNA探针,将探针与固定在NC膜上的DNA或RNA进行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。,探针技术的概念,二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹技术(Southernblotting),（二）RNA印迹技术(Northernblotting),（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting),（一）Southernblotting,10SSC转移缓冲液,Whatman滤纸,凝胶,Whatman滤纸,纸巾,玻璃板,重物,与探针同源杂交的基因DNA片段,基因组DNA,DNA酶切片段,NC或尼龙膜,NC膜或尼龙膜,基因组DNA的定性与定量分析。如对在基因组中特异基因的定位及检测等。重组质粒和噬菌体的分析。,Southertblotting用途,放射自显影照片,（二）RNA印迹技术(Northernblotting),相同点：,AlwineJC,etal.MethodfordetectionofspecificRNAsinagarosegelsbytransfertodiazobenzyloxymethyl-paperandhybridizationwithDNAprobes.ProcNatlAcadSciUSA,1977,74(12):5350-5354,原始文献出处,名称相对于Southernblotting,转移的是RNA转移前无需酶切转移效率较高变性方法,不同点,原理均为毛细作用。,（二）RNA印迹技术,Northernblotting用途检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。,Northernblotting结果,由于基因组测序的完成及基因芯片技术的成熟以上两种技术应用的越来越少,（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹),首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。,与DNA和RNA印迹相似之处,蛋白质的转移只有靠电转移。蛋白质的检测以抗体作探针。用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。,与DNA和RNA印迹不同之处,Westernblotting应用,检测样品中的特异蛋白质的存在。细胞中特异蛋白质的定量分析。蛋白质分子的相互作用研究。,Westernblotting应用,SDS-PAGEpurifiedrecombinanthumanCK2subunitanditsWesternblotting,用已知的特异抗体检测目的基因蛋白,三种印迹技术的比较,斑点或狭线印迹(dotorslotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA芯片技术(DNAchip),其他印迹技术,三PCR技术的原理与应用,（PolymeraseChainReaction，PCR）,聚合酶链反应,PCR技术是1985年由美国科学家KaryBMullis建立的体外扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等突出优点，是分子生物学技术中一项具有革命性的创举。,PCR方法被美国Science杂志评为1989年的十大科技成就之一，而TaqDNA聚合酶被评选为象征1989年的“年分子”(themoleculeofyear)。,TheNobelPrizeinChemistry1993,forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistry,MichaelSmith,1944-,1932-2000,LaJolla,CA,USA,KaryB.Mullis,UniversityofBritishColumbiaVancouver,Canada,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method,forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies,5,Primer1,5,Primer2,5,5,TemplateDNA,一、PCR技术的工作原理,模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+,PCR体系基本组成成分,PCR反应循环,变性95C左右,延伸适温,退火Tm-5C,经过30个左右的循环后，PCR的扩增倍数为(1+x)n,x=75%,n为循环数.,2.利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段。,3.利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段。,4.利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机克隆基因。,1.与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段。,二、PCR技术的主要用途,（一）目的基因的克隆,（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析,二、PCR技术的主要用途,三、几种重要的PCR衍生技术,（一）反转录PCR技术(RT-PCR)（二）实时PCR技术(realtimePCR)（三）反向PCR（inversePCR）（四）不对称PCR（asymmetricPCR）（五）复合PCR（MultiplexPCR）（六）随机引物PCR(arbitraryprimerPCR),RT-PCR技术,AAnA,TTnT5,5,mRNA,反转录酶,mRNA,cDNA,3,TTnT,AAnA,核糖核酸酶H,TTnT,3,DNApolyI,cDNA,核酸酶S1,双链cDNA,3,5,3,5,5,加热变性,加入特异性引物,DNA聚合酶,PCR,扩增出大量的产物,实时PCR技术原理,反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段。,反向PCR（inversePCR）,是一种二条DNA模板不等扩增的PCR，通过调整一对引物浓度（如100：1），使扩增出的产物大部分为浓度高引物合成的单链DNA。有利于测序或制备探针。,不对称PCR（asymmetricPCR）：,用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法称为复合PCR。,复合PCR（MultiplexPCR）：,RAPD（RandomAmplificationofPolymorphicDNA）随机引物扩增多态DNA，或随机引物扩增PCR（arbitraryprimerPCR,AP-PCR）。常规PCR通常扩增一个已知DNA片段，所设计的引物也是根据相应序列的侧翼顺序。扩增产物为一个特异片段。RAPD包含多个PCR反应和多个引物，引物是随意设计的10bp片段，其扩增的是一组未知的片段，在事先不知道DNA序列的情况下，产生DNA指纹模式，可进行亲缘关系分析、系统发育分子水平的鉴定。如果在二个基因组的RAPD反应用同一组引物，则可以比较基因组间的差异。利用这种差异有可能追踪性状的差异。,四核酸序列分析Nucleicacidsequenceanalysis,核酸序列分析的基本原理,化学裂解法(Maxam-Gillbert法)-略,DNA链的末端合成终止法(Sanger法),(Sanger双脱氧链终止法),HOPOPOPOCH2,O,A,C,GorT,1,3,OH,5,双脱氧核苷三磷酸,脱去,二、DNA链末端合成终止法,Sanger1958年和1980年两次获Nobel奖,TheNobelPrizeinChemistry1980,forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNA,fortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacids,PaulBerg,WalterGilbert,FrederickSanger,1/2oftheprize,1/4oftheprize,1/4oftheprize,StanfordUniversityStanford,CA,USA,HarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USA,MRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom,1926-,1932-,1918-,三、DNA自动测序,用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记4种ddNTP，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。通过4种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,ABIPRISM310型DNA测序仪,主要用于DNA序列分析(包括DNA测序,卫星序列、杂合子序列和三联体序列分析，单链构象多态分析,长片段PCR分析)，遗传疾病诊断，亲子鉴定等,PE3700型DNA测序仪,DNA自动测序结果举例,五、生物大分子相互作用研究技术TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy,一、蛋白质相互作用研究技术,酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选,常用蛋白质相互作用的研究技术,标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。,（一）