细胞培养技术17577PPT课件

细胞培养基础知识,覃兆鲜,细胞培养理论部分内容,1、细胞培养概念：细胞培养是指用机械法或酶消化法从组织中分离出细胞，并摹拟体内环境，在无菌、适当温度、酸碱度和营养条件下，使其生长增殖，并维持其正常结构和功能的一种培养技术.,2、细胞培养原理：细胞培养原理简单的来说，就是在体外营造一个同机体内细胞生存环境相似的人工环境，从而可以使细胞在体外生存、生长、增殖,3、体内、外细胞的差异,体内细胞：机体神经体液调节和其他类型细胞影响基因表达受到外来信号调节增殖过程中不断发生着分化（由一般到特殊）高度特化的结构和功能,体外细胞：失去机体神经体液调节和其他类型细胞影响细胞的许多外来信号被切断特定分化基因表达减弱或停止而进化中保守的增殖活动维持（由特殊到一般）与体内细胞结构和功能的差异特征：失去原有形态，分化特性减弱形态和功能趋于单一一定代数后衰老死亡，或发生转化，获不死性而成为能无限传代,4、体外培养细胞类型,贴壁依赖性细胞贴附于玻璃、或塑料等无活性物质的表面生长、生存和维持。悬浮培养细胞细胞悬浮于液体培养基中增殖。,5、细胞周期细胞周期：细胞前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程.G0期：细胞不再沿周期进行，进入休眠状态，G1期，-DNA复制前期，主要进行RNA合成和蛋白质合成，为染色体复制做准备,S期-DNA复制期，完成DNA复制,G2期-DNA复制后期，为纺锤丝的形成做准备,M期:有丝分裂期。群体中多数细胞处于间期，少数处于分裂期。分裂期较短。,整个细胞周期可划分为G1SG2MG1，如下图所示：,细胞生长曲线,体外培养的细胞生长达到一定密度后，都需传代。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。细胞增殖一代，一般要经过以下三个阶段：,细胞生长曲线图:可用MTT法测定。用BRDU检测有丝分裂的细胞。,BRDU（溴脱氧尿嘧啶核苷)与胸腺嘧啶结构相似，在DNA合成过程中与胸腺嘧啶一样能掺入细胞DNA中，用BRDU单克隆抗体免疫细胞化学法可检测BRDU标记的结果，可直接观察DNA的合成过程，从而能客观地评价培养细胞的增殖分化情况，同时能避免对细胞的放射性损害。,细胞调亡,细胞凋亡是细胞自身程序结束,生命主动死亡的过程，具有特征的形态和生化改变，是由基因控制的自主有序的,有选择性的自我消亡过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础。,细胞凋亡特征,凋亡发生的过程表现（细胞缩小致密染色质边集核碎片凋亡小体）1、丧失了特殊的表面结构（微绒毛等）和接触区，形成光滑的轮廓，从周围活细胞中分离出来2、细胞缩小：胞浆细胞器集中胞膜出芽或起泡细胞皱缩；,3、保持胞浆细胞器完整性扫描电镜下，细胞表面呈奇特火山口样外观，线粒体不肿胀，内膜不破裂；短暂滑面内质网（SEN）扩张，扩张间隙与细胞表面融合；有时有聚积排例的半结晶状核糖体；可有与细胞表面平行的微丝束。4、形成调亡小体由凋亡细胞裂解为若干个由质膜包绕的小体，每个凋亡小体有自己的一簇细胞器。周围不引起炎症反应。,5、核内染色质结构改变（这是最引人注意的改变）染色质凝集于核膜下表现为：核质固缩；边集；核浆紧实；核膜皱折。,AnnexinV是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一，在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧，AnnexinV与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。,细胞体外培养的影响因素,血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)和其它动物血清。由于不同的研究目的，血清成分往往干扰研究实验，如进行药物和受体及营养等方面的研究时，需要使用无血清培养基。,pH值：大多数细胞在pH7.4时生长最好，一般不低于6.8，不高于7.6。渗透压：培养液渗透压一般介于260320mosm/kg之间,培养液:目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根据培养需求合理选择贴壁和铺展因子，如某些细胞培养初不易贴壁,可以预先用0.1%明胶或多聚赖氨酸包被瓶皿.,细胞培养基本过程,取材无菌环境中，从机体取出某种组织（视实验目的而定），经过一定的处理（如消毒、消化分散等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。取材后应尽快培养，因故不能马上培养时，置4的培养液中保存，但时间不能超过24h。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他有害物质。取病理组织、皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染，可用5001000单位/ml青、链霉素的PBS液漂洗510min。（无论是传代培养还是原代，对细胞进行操作切记：细心，专心，动作要轻）,原代培养：从组织上取得的细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为原代培养。原代培养有两种方法：酶消化法和组织块法。（以水牛成纤维细胞BEF为例,组织块法：屠宰场胎牛-回到实验室用75%酒精喷整个牛体，剪一小块腿部肌肉-PBS洗两次-移入操净台-把小块肌肉剪为绿豆颗粒大小-75%酒精浸泡1分钟-PBS洗3次-把小组织块均匀排在培养瓶底部（组织块与组织块之间要留有空隙）-加少许培养液（培养液以稍微浸过组织块为宜）-培养第二天补加少许培养液-再过两天-换液加入新的培养液（此时组织块已贴培养瓶底部，培养液以浸过组织块，铺满培养瓶底部为宜）-后每隔2-3天换液一次，直到细胞铺满培养瓶底部-细胞长满时可用注射器针把组织块给挑出，然后传代细胞。一般7-8天细胞可以长满。,胰蛋白酶消化法屠宰场胎牛-回到实验室用75%酒精喷整个牛体，剪一小块腿部肌肉-PBS洗两次-移入操净台-把小块肌肉剪为绿豆颗粒大小-75%酒精浸泡1分钟-PBS洗3次-把组织块放入20ml的小瓶用剪刀把组织剪碎-加入3-4ml的胰蛋白酶放入培养箱消化组织-每隔10分钟用吸管把组织给反复吹散利于细胞解离出-当看到液体混浊基本没有块状时，吸少许放入显微镜下观察，当发现细胞大部分解离时加1-2ml含血清的DMEN培养液终止消化-移入离心管-1500-2000转/分钟离心6分钟-弃掉上清液-加入培养液重悬细胞把细胞轻轻吹散后放入细胞培养瓶培养。一般5-6天细胞可以长满。,图2-1组织块培养5天的水牛图2-2酶消化法培养5天的水牛胎儿成纤维细胞胎儿成纤维细胞,传代培养当细胞铺满细胞培养瓶底部时就要及时对细胞进行传代，否则细胞生长会受到影响。每传代一次称为“一代”。有限细胞系在体外一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。加入0.25%胰蛋白酶到培养瓶中以刚好铺满培养瓶底部为宜-酶消化约5分钟显微镜下观察到大部分细胞漂浮起来为宜-加入含血清的培养液终止消化-移入离心管-1500-2000转/分钟离心6分钟-弃掉上清液-加入培养液重悬细胞把细胞轻轻吹散后放入细胞培养瓶培养一般是1：3传-每隔2-3天换液一次，并每天要观察细胞形态变化。,细胞冷冻细胞冻存和复苏是细胞培养不可缺少的步骤。为了避免细胞在体外长期培养时丢失，对细胞要及时冻存。但当细胞离开活体开始原代培养后，它的各种生物学特性都将逐渐发生变化，并随着传代次数的增加和体外培养条件的变化而不断有新的变化。因此，及时冻存低代细胞是很必要的（一般冷冻2-3代细胞为宜）。,细胞冷冻原理在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成结晶，能导致细胞内发生一系列变化，如电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、等，能引起细胞死亡。向培养基中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。贮存在130以下低温中能减少冰晶的形成。溶解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50。,冷冻方法1.选用对数生长期细胞，在收集细胞24h前换液一次。2.用常规胰蛋白酶消化将细胞消化下来，按106-107/ml细胞浓度，悬浮于含10DMSO的培养液中（此时培养液要冷的，因DMSO仔常温下可以产生毒性）3.用吸管吸取细胞悬液，分装于0.25ml的细胞冻存管中用火烧封口。4.冻存4半个小时-202小时-80过夜-液氮长期保存。,解冻方法1将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入37水浴中使其在1min内融化。2.用75%酒精喷细胞冷冻细管用灭菌过的纱布擦试细管-用灭菌过剪刀剪掉细管2头-将细胞悬液移至离心管中，补加培养液，1500rpm低速离心6min，去上清（DMSO在常温下对细胞有毒，应在细胞复苏后尽量除去）-弃掉上清液、加培养液进行培养-第二天待细胞贴壁时进行换液把死的细胞去除-后每隔2-3天换液-待细胞生长至一定密度后即可传代。（解冻方法速度一定要快）,细胞活力1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。2、加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状,染色体检查,（1）将一瓶处于对数生长期的细胞放入4冰箱12小时，然后弃去旧液，分别加入含秋水仙素终浓度为0.40.6g/ml的DMEM培养液继续培养46小时，收集细胞。（2）弃离心上清，加入预热的0.5毫升KCl(0.075m/ml)混匀，后补加到5ml，37孵育35分钟（此步骤为低渗，让细胞膜破裂）。（3）加入1ml新配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）预固定3分钟，离心收集细胞。（4）弃离心上清，再缓缓加入5ml固定液4冰箱中固定50分钟，低速离心收集细胞。（5）弃离心上清，加入0.7ml固定液，反复吹打混匀。（6）取-20冰冻的载玻片，吸取悬液于25cm高度（保持一定的高度利于染色体分散开利于计数）滴于载玻片上，在酒精灯上迅速烘干，用Giemasa(原液：PBS=1:9)染色30分钟，冲洗，干燥。显微镜下观察,水牛胎儿成纤维细胞染色体,免疫细胞染色,免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗体标记上荧光素,再以这种荧光抗体作为探针检查细胞或组织内的抗原.,在细胞或组织形成的抗原抗体复合物上含有荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受发光的照射而发出明显的荧光,可以看见荧光所在细胞或组织,从而确定抗原的性质、定位以及利用定量技术测定定量。,荧光抗体,、（异硫氰酸荧光素）标记，最大吸收光谱为nm最大发射光谱为，呈黄绿色荧光。2、四乙基异硫氰酸罗达明（）标记最大吸收光谱为nm，最大发射光谱为nm，橙红色荧光，与的黄绿色光对比清晰，与蛋白质结合方式同，可以用来双标记研究。,细胞免疫荧光染色基本步骤,1、把灭菌的盖玻片放入培养皿中然后细胞接种培养。2、吸出培养液加入4%多聚甲醛室温固定15min（为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。),3、吸出旧液0.01%Ttitonx-100的TBSA洗3次，加1%Ttitonx-100的PBS室温作用5min（目的是提高细胞的通透性利于抗体进入）4、吸出去污剂，用0.01%Ttitonx-100的TBSA将盖玻片洗三次，各5min，弃液体但不要干燥.5.1%BSA封1h。,6、加入一定比例一抗避光孵育60min（如需孵育更长时间可以考虑在培养箱里保持湿润避免干燥，如有必要则在4度冰箱中孵育过夜）7、0.01%Ttitonx-100TBSA洗几次，后加FITC标记的二抗室温标记60min。,8、0.01%Ttitonx-100TBSA洗三次.（如果抗原是表达在细胞膜或细胞质可以用PI复染10分钟，这样细胞的整个形态显出利于分析抗原的定位）9、在干净的盖玻片上滴一滴封固液，翻转盖玻片，使细胞面朝下，置于封固液上，封片,污染防治,污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。一开始就要十分重视，应积极采取措施，防止污染否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。,细菌污染细菌污染是实验室细胞培养常见的污染，即使在细胞培养液中加入抗生素也可能因为操作原因引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌。此污染培养液会发生混浊，PH值会发生改变。细胞胞内颗粒较多，严重的细胞脱落死亡。,真菌污染真菌污染也是细胞培养中常见的污染，此污染可以看见到培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊，显微镜下可看见丝状，管状或树枝状的菌丝排列纵横交错在细胞之间或培养液中，有的呈链状排列。真菌污染后细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。,支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径为0.2微米，一般过滤除菌可以除掉，光镜下很难看见它的结构。支原体污染开始不容易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗性，多吸附于细胞表面或散在细胞之间。电镜下可见其有三呈结构。细胞受到支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增值变慢，部分贴壁细胞变圆，从培养瓶脱落，但多数细胞污染后无明显变化。,病毒污染采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除掉潜在病毒组织培养物，就会产生病毒污染非同种细胞污染细胞培养操作中各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开或操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染,污染判断,污染的鉴别，细菌.真菌污染的检测肉眼观察细菌、真菌污染常在传代，换液，加样等开放性操作后发生，而且增生很快，若有污染在48小时内可以明显观察到，如培养液混浊，略加振荡有很多漂浮物漂起。镜下观察倒置显微镜下的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状，管状，树枝状或卵形的物质常为真菌污染。,污染的清除和预防,培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，可以弃掉。若污染细胞价值达，难重新得到，可以采取以下方法清除（1）使用高浓度抗生素抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药