《相对定量分析》PPT课件

,荧光定量PCR应用,相对定量胡顺2,相对定量的原理相对定量实验的分析方法相对定量实验设计总结,3,PCR定量实验概述,相对定量,4,相对定量PCR实验目的和要求,相对定量实验的目的是用于研究样本中某个或某些核酸表达水平的差异。优点：能够检测目的基因“量”的细微变化长期实验及不同实验体系中所得数据能够进行比较,5,相对定量原理(I),利用内参基因(=内源性对照)对样本间的差异进行归一化处理,Step1:相同样品中的目标基因和参比基因的浓度Step2:不同样品中目的基因的含量差别由参比基因校正,参比基因可以修正：样品起始量的差别样品中核酸回收率的差别样品中可能的RNA降解不同样品中核酸质量的差别加样差,参比基因的选择,理想的参比基因:表达水平在所有样品中是持续、稳定的：正常组织vs.肿瘤组织表达水平不受实验条件变化的影响：处理样本vs.未处理的样本看家基因(Housekeepinggenes)：编码有基础细胞功能的蛋白质,7,ReferenceGeneSelection,Normalizationofgeneexpressionmeasurementsintumortissues:comparisonof13endogenouscontrolgenesdeKokJB,RoelofsRW,GiesendorfBA,PenningsJL,WaasET,FeuthT,SwinkelsDW,SpanPN.LabInvest.200585(1):154-159ReferencegenesidentifiedinSH-SY5Ycellsusingcustom-madegenearrayswithvalidationbyqPCRHoerndliFJ,ToigoM,SchildA,GotzJ,DayPJ.AnalBiochem.2004335(1):30-41DeterminationofaninternalcontroltoapplyreversetranscriptionquantitativePCRtostudystressresponseinthelacticacidbacteriumOenococcusoeni.DesrocheN,BeltramoC,GuzzoJ.JMicrobiolMethods.200560(3):325-33.Evaluationofpotentialreferencegenesinreal-timeRT-PCRstudiesofAtlanticsalmon.OlsvikPA,LieKK,JordalAE,NilsenTO,HordvikI.BMCMolBiol.2005Nov17;6:21.Selectionofreferencegenesforquantitativereal-timePCRinbovinepreimplantationembryos.GoossensK,VanPouckeM,VanSoomA,VandesompeleJ,VanZeverenA,PeelmanLJ.BMCDevBiol.20055:27.,使用校准品样本(calibrator)对最终分析结果进行进一步的均一化校准同次实验中目的基因与参比基因的检测灵敏度校正不同次实验间runtorunfixeddynamicrange)benefitofin-runstandard(inter-assaycalibration),44,相对定量的原理相对定量实验的分析方法LightCyclerSoftware操作相对定量实验设计总结,45,通过内参基因均一化校正不同样本来源核酸质量及含量的差异通过校准样品均一化校正不同实验批次以及不同试剂批号之间的差异扩增效率的考量无扩增效率的校正E=2incasePCRefficienciesoftargetandreferencearedifferentandE2editEvaluestandardcurvesinrunorimportofstandardcurveobjectslinearornon-linearstandardcurve(fitdependingondata),相对定量软件的特点及优势,46,相对定量分析方法流程,combinableastemplate,47,LightCycler480Software,Version1.5相对定量分析方法比较,48,TerminologyUsedinDifferentSoftwareSummary,Doingnowwhatpatientsneednext,50,TypesofQuantification,Real-TimePCRQuantificationPrinciples,AbsoluteQuantification,RelativeQuantification,ExternalStandards(monocolor),ExternalStandards(withoutcalibrator),Calibrator-NormalizedMethod,withoutEffi