兽医生物制品电子教案

.第一章 绪 论第一节 兽用生物制品的概念与命名原则一、兽用生物制品与兽用生物制品技术（一）兽用生物制品的概念兽用生物制品：是根据免疫学原理，利用微生物、寄生虫及其代谢产物或免疫应答产物制备的一类物质。这类物质专供相应疾病的诊断、预防和治疗之用。狭义上讲，兽用生物制品主要指疫苗、免疫抗血清及诊断制剂；广义上讲，兽用生物制品还应包括各种血液制剂、抗生素、非特异性免疫制剂等。由此可见，兽用生物制品的含义和内容也将随着科学技术的发展而成为兽用保健制品。（二）兽用生物制品技术概念与内容兽用生物制品技术：兽用生物制品技术是在动物微生物、免疫学、动物传染病的基础上，采用生物学、生物化学及生物工程等技术和方法，研究和制备兽用生物制品，用以解决动物疫病防治的一门新兴应用技术。主要内容包括两个方面：1是兽用生物制品的生物学，即研究病原微生物及宿主的关系。2是研究兽用生物制品的工艺学、制造、保藏、使用方面的内容。二、 兽用生物制品的命名原则农业部规定的兽医新生物制品管理办法有10条原则1、 命名原则：明确，简练，科学。2、 不用商品名和代号。3、 一般制品为：动物名称+病名+制品名称，如猪瘟兔化弱毒疫苗。4、 共患病不列出动物名：如破伤风类毒素或抗毒素。5、 疫苗名称要规范，主动免疫的菌苗，疫苗统称为疫苗。6、 分活疫苗和死疫苗。7、 同一类不同毒株的疫苗，全称后面加括号注明，如猪丹毒活疫苗（GC42）-是哈尔滨兽研所通过豚鼠370代选育后，再通过雏鸡42代选育成的弱毒疫苗。猪丹毒活疫苗（G4T10）是江苏兽研所，将370代的菌，再通过培养基里加锥黄素，50代选育的。8、 联苗：动物名称+若干病名+X联苗，如猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联疫苗。简称猪三联。9、 多价苗：动物名+病名+若干血清型+X价疫苗，如仔猪黄白痢K88，K99，P987三价弱毒疫苗。10、生物制品制造方法不注明，属企业秘密。第二节 兽用生物制品的分类及应用一、兽用生物制品的分类兽用生物制品种类繁多，只有进行分类，才便于学习和实践中使用和区别，常规的分类有两种，1是按性质和用途分类；2是按物理和制造进行分类，下面先讲第一种分类方法。（一） 兽用生物制品按性质分类： 有预防用的疫苗和类毒素，有诊断用的诊断剂，有治疗用的高免血清，有调整微生态平衡的微生态制剂，以及非特异免疫增强剂等。 1、疫苗（vaccine）：接种动物能产生自动免疫的一类生物制品，有微生物、寄生虫及其代谢产物组成。过去人们习惯将病毒、立克次氏体制成的叫疫苗，将细菌、支原体和螺旋体制成的叫菌苗。现在农业部统一规定，“由特定细菌、病毒、立克次氏体、螺旋体、支原体，及寄生虫制成的主动免疫制品，一律称为疫苗，可分别叫它们什么细菌疫苗或什么病毒疫苗。（1）常规疫苗：由病原微生物完整本身加工制备的叫之。 A、灭活疫苗（死疫苗）：用物理或化学方法将病原微生物杀死，仍保留免疫原性。一般是由强毒力微生物制成，多加上佐剂，提高免疫效果。 灭活疫苗的优缺点： 优点：a，安全，无副作用，不返祖不散毒。 B，不中和母源抗体和机体抗体。 C，运输保存方便，多为水剂湿苗。 缺点：a，需多次免疫，抗原用量大，价格贵。 B，只能注射，需要佐剂，仅刺激体液免疫。弱毒疫苗的优缺点和灭活疫苗相反，不再重复。a) 自身或自家灭活疫苗从患病动物自身病灶分离病原微生物制成的灭活疫苗，如人反复葡萄球菌感染，可选用此方法做苗；对动物可用本场分离的病菌制成灭活疫苗，用于本场，具有抗原的针对性，如仔猪黄白痢自家灭活疫苗，链球菌自家灭活疫苗。b) 组织灭活疫苗利用含病原微生物多的组织制成的灭活疫苗，如兔瘟灭活疫苗，猪园环病毒自家组织灭活苗。B、活苗（弱毒疫苗） 用人工方法使病原微生物变异减毒而制成。 分强毒活疫苗，如宋朝我国制备的人痘疫苗；还有中等毒力的鸡新城疫I系，法氏囊中等毒力苗，传支H52等。 弱毒疫苗：卡介苗人工培育13年230代；鸡新城疫I系自然脱毒筛选；炭疽疫苗高温诱变。猪瘟兔化弱毒疫苗钝感动物。 化学诱变疫苗：猪丹毒疫苗培养基里加锥黄素；仔猪副伤寒疫苗培养基里加醋酸砣；猪肺疫疫苗培养基加海鸥洗衣粉。a) 同源疫苗：由病原微生物本身减毒制成，大多数是这样的疫苗。b) 异源疫苗：含同类属抗原的非同种微生物制备成。如：鸡马立克氏病，用火鸡疱疹病毒疫苗预防；犬瘟热病-用人麻疹疫苗可以预防；人天花病用牛痘疫苗预防。 在疫苗中，仅有少数是异源疫苗，即不同微生物，同类抗原少，像钥匙开锁一样，其他钥匙开这个锁纯属偶然。c) 单价疫苗：利用同一株微生物（这个微生物就一个血清型）或一种微生物的单一抗原制成。如猪大肠杆菌K88疫苗，禽流感H5N1疫苗。d) 多价疫苗：是同一种微生物的若干血清抗原菌株制成 ，如：大肠杆菌K88，K99，P987三价疫苗；口蹄疫O、A双价疫苗。e) 混合疫苗，又叫联苗：不同微生物按一定方法混合制成，如：猪三联疫苗，即是猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联疫苗。（2）新型疫苗A. 亚单位疫苗：利用微生物一种或几种亚单位结构制成的疫苗。如：流感的血凝素，神经氨酸酶，肺炎双球菌的荚膜多糖等，都可以做成疫苗。B. 化学疫苗：用化学方法提取微生物的有效免疫成分而制成。比亚单位疫苗更简单，如提取荚膜多糖可以做成。C. 合成肽苗：人工合成肽抗原，与适当载体和佐剂配合而成。如流感病毒的18肽疫苗，口蹄疫的多肽疫苗已经使用。D. 基因工程疫苗：通过DNA重组技术而制成的新型疫苗，主要有：a) 基因缺失疫苗：切除病原微生物的有害基因而制成，如伪狂犬TK基因缺失，还有gE，gG基因的缺失。b) 基因工程活载体疫苗：将目的基因插入到细菌或病毒体内表达。如将流感病毒血凝素基因插入到牛痘疫苗，将志贺氏菌的基因插入到沙门氏菌中表达。c) 病毒抗体复合物疫苗：是由相应抗体包埋病毒制成。特点是安全，病毒缓慢释放。d) 基因疫苗：即DNA疫苗，将编码某种蛋白质的DNA注入体内，在体内表达出某种蛋白质抗原，具有免疫作用。自杀DNA疫苗：为防止DNA重组或改变机体的基因，或使机体致癌，设计了自杀DNA疫苗，即该基因注入体内后，复制若干代后自动关闭。e) 抗独特疫苗：利用抗原和抗体是镜像关系原理设计出的疫苗。 Ag-动物-Ab1 -Ab1-动物-Ab2（抗独特疫苗） Ab2-动物-Ab3， 这里Ag和Ab2是一样的，Ab1和Ab3是一样的。 利用抗独特疫苗免疫动物，使动物产生的抗体（Ab3=Ab1）可对抗原来的。微生物。E.类毒素（脱毒毒素）: 由细菌外毒素经过0、3%-0、4%甲醛处理脱毒制成，如破伤风类毒素，白喉类毒素。2、 诊断剂用于免疫学诊断，是由抗原或抗体组成，原理是抗原或抗体是特异性结合，利用已知一方，可以检测另一方的存在。实际中可以用于传染病诊断，抗体水平检测以及病原微生物的鉴定。常用的有以下6类方法：2) 凝集反应用的抗原或抗体：如鸡白痢或布氏杆菌凝集抗原。3) 补体结合反应用的抗原或抗体。4) 沉淀反应：炭疽沉淀反应ascoli实验，法氏囊抗体检测。5) 标记用抗原或抗体：荧光抗体，酶标抗体-elisa6) 鉴定细菌用的多价血清或因子血清沙门氏菌7) PCR-聚合酶链反应3、 高免血清 人工高度免疫动物提取的血清，用于传染病的治疗和紧急预防如猪瘟血清，小鹅瘟血清，法氏囊卵黄抗体等。4、 微生态制剂即益生素或叫EM（有效的微生物制剂），是有益的活菌制剂，调节机体微生态平衡，达到预防或治疗疾病的目的。常见的细菌有乳酸杆菌、双歧杆菌、地衣芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌等。益生元：促进有益细菌生长的物质，如双歧因子，寡聚糖等。 (二)按制造方法和物理性状分类 1、普通制品：一般方法制备的生物制品，如炭疽杆菌芽孢苗。 2、精制制品：对普通制品进行浓缩和精制，如精制的破伤风类毒素或抗毒素。 3、液状制品：也叫湿苗，多为灭活疫苗或诊断制品。 4、冻干制品：将疫苗冷冻干燥，可更好保护微生物的活性，弱毒疫苗多为冻干制品，另激素、血清、补体等也可以冻干。 5、佐剂制品：非特异增强疫苗的免疫应答物质，如铝胶，蜂胶，油类，卡介苗等。二、兽用生物制品的应用1.用于动物疫病的防治2.用于动物疫病的诊断3.用于动物疫病的治疗 4.用于动物的保健第三节 兽用生物制品的发展史与发展前景一、兽用生物制品的发展史古代历史上的成绩：早在1000多年前，宋真宗时期，我国人民就已经会用痊愈天花病人的干痘痂粉，吹入鼻孔，预防人的天花病，叫吹花。后传给俄罗斯和土、耳其等国家。预防牛瘟，我国甘肃省早知道，用康复牛的血，灌服给其他牛，可以预防牛瘟。1796年，英国乡村医生琴纳，用牛痘浆给人接种预防天花成功，1980年全世界消灭了天花疫苗也叫牛痘苗的代名词（vaccine），沿用至今。1881-1884年，法国巴斯德，发明了炭疽疫苗、禽霍乱疫苗及狂犬疫苗。1921年，卡介苗诞生，用13年230代培育成功。后又发展有白喉抗毒素及破伤风类毒素和抗毒素。我国猪瘟兔化弱毒疫苗质量世界第一；发明的 牛肺疫兔化弱毒疫苗，为我国消灭牛肺疫起到了关键作用，马传贫白细胞活疫苗，为 我国填补了空白，猪三联弱毒疫苗，也是我国首创打破了细菌和病毒疫苗不能混合生产的 历史。其次，畜禽常用的疫苗和血清，我国都可以自己生产。特殊疫苗，我国研制有鸡球虫病疫苗，猪囊虫疫苗及弓形体疫苗。还有水产用的嗜气单胞菌疫苗和 草鱼出血热灭活疫苗。辅助治疗的副免疫制品有猪干扰素，白细胞介素等。冻干技术的改进，用真空箱内压盖技术，为弱毒疫苗生产质量提高作出了贡献。华中农大程焕春院士，自主开发研制的伪狂犬基因缺失疫苗，填补了我国该疫苗的 空白。我国除上述生物制品外，还开发研制了大量诊断试剂，传统有鸡白痢全血平板凝集抗原和布氏凝集抗原，结核菌素等。新研制有ELISA各种诊断试剂，基本满足国内畜禽疾病的诊断。 2001年时，我国兽医生物制品有188种，灭活疫苗56种，活疫苗57种，抗血清7种，诊断试剂61种，其他制品7种。最近几年，我国新增生物制品更多，有力的促进了我国畜牧业的发展。二、兽用生物制品的发展前景我国养殖业发展速度快，猪鸡的饲养跃居世界第一。但是，畜禽疫病十分严重，我国畜禽出栏率比外国发达地区低的多。新疫病不断出现，旧的病死灰复燃。当前，迫切需要高质量的生物制品来解决问题，今后生物制品的方向应该是：1、 传统疫苗为主，多联多价苗倍出传统疫苗有质量稳定，价格低廉的优势，在农村广大地区，起主导作用；一些多联多价疫苗，将降低劳动成本，成为畜牧业发展的新需求。2、 提高疫苗质量，研制新型疫苗SPF，是 指无特定病源动物，鸡胚，细胞是弱毒疫苗质量的关键，但是，部分疫苗不是用SPF原料生产的，造成疫苗的污染和散毒，需要从原料上进行治理。还有新的疫病无疫苗预防：圆环病毒，蓝耳病，鸡白痢等，需要加大研究力度。3、 研究新型的基因工程疫苗是发展方向我国已经有伪狂犬基因缺失疫苗，对筛选野毒携带起重要作用，如果把这个技术推广到猪瘟等其它疫苗上，将更好地净化野毒的携带者。DNA疫苗也是发展的 方向。4、 试剂盒标准化，简单化当前我国试剂盒不稳定，非特异性高，需要国家扶持和发展；国外质量高，但价格贵，不适用农村推广；操作麻烦也是解决的问题。5、 微生态制剂、寄生虫疫苗、鱼类疫苗发展空间大我国加入WTO，要求出口绿色产品，为达到这个质量，就需要微生态制剂；寄生虫和鱼类疫苗特少，需要研究开发。6、 加快生物制品GMP建设，与世界接轨全国06年就要求兽医药厂，必须达到GMP标准，否则要关闭；但是，有借批号的，合并、分厂现象多。是上有政策，下有对策。7、 完善兽医法规，加强生物制品管理我国已经颁布了中华人民共和国防疫法和兽医生物制品管理办法，问题是 执行不力，监督不力，需要进一步完善和加强。学习外国兽医官制度，是当务之急。思考题：1、基本概念：兽用生物制品，兽用生物制品技术，疫苗，弱毒疫苗，灭活疫苗。2、简述生物制品的分类与应用。3、简述生物制品的命名原则。4、结合我国兽用生物制品现状，试述兽用生物制品的发展前景。 第二章 细菌和病毒的培养技术 第一节 细菌培养技术细菌培养技术是生物制品制造的基础，一些内容在微生物学已经学习过，这里主要讲一些重要的细菌培养技术。一、细菌培养技术熟悉细菌的生长曲线，因为不同的生物制品，要用不同时期的细菌，如细菌疫苗，要数期或稳定期细菌；芽孢疫苗，要衰老期细菌；外毒素要老龄细菌。其次，要根据不同细菌用不同的培养基进行培养，用不同的培养方法（需要氧气，微需氧，厌氧。另培养温度，pH，渗透压等。）。二、细菌培养的基本技术步骤：先分离出单个菌落斜面培养基生化或血清鉴定菌种保存生产生物制品先接种到斜面菌种小三角瓶肉汤大三角瓶肉汤。（一）细菌分离培养（目的是稀释病料，得到单个典型菌落）。1、需氧菌分离培养：分段划线、倾注培养。2、微需氧培养：鸭疫巴氏杆菌，牛布氏杆菌病，猪传染性胸膜肺炎菌等，用蜡烛缸方法。3、厌氧菌培养：用疱肉基，物理除氧气（加氮气，氢气），化学除氧：焦性没食子酸加烧碱。（二）细菌的规模培养生物制品是产品，一般要大规模培养，才能满足基层需要。1、菌种接种量：1-3%，过少生长慢，过度带入有害产物多，影响生长。2、培养时间：菌苗，对数期和稳定期的细菌好；芽孢疫苗：衰老期细菌；外毒素：需要1周时间培养。在培养过程中，如果有少量污染，可以提前灭活终止培养。3、培养方法：根据不同制品的性质和要求，选育不同方法。固体表面培养：多用于诊断剂，也有菌苗生产。可随意调节细菌浓度，但操作麻烦，劳动量大。培养方法有克氏瓶，大平皿，到入菌夜，L玻棒刮抹接种，培养后加生理盐水，再用L棒刮洗下细菌混悬液。液体静止培养：一般细菌疫苗多用，用大三角瓶（5000ml）或发酵罐，装入培养基1/2-2/3量，需氧培养，要5小时摇动一次，增加氧气浓度。培养厌氧细菌，可以装满培养基，上面加少量石蜡油，隔绝空气，下加肝块或肉渣（疱肉基），它们氧化，吸收氧气，达到除氧气目的。液体培养含菌量低，多需要浓缩。液体深层通气培养（发酵罐）：可自动调节温度、氧气、pH、营养、搅拌，注意消泡沫和污染。透析培养：半渗透膜作用，营养可以不断补充，可以提高细菌和毒素含量。连续培养：营养不断加入，培养好的细菌不断流出。（三）细菌计数技术细菌疫苗必须有一定含菌量，才有好的免疫效果。所以，应该对生产的疫苗计算含菌量。1、直接显微镜检查计数定量定面积染色计数：10vul菌夜，涂抹1cm2面积的载玻片上，干燥固定染色，油镜下观察，油镜直径是0、16mm，视野面积是0、02mm2，1cm2面积有50万个油镜视野，多观察几个视野，算出一个视野细菌平均数X50万X100，即每ml含细菌量。比例法计数（也叫对照法）如用已知人红细胞为500万/mm3（可以把红细胞0、4%甲醛固定，长期使用），取一环红细胞放在载玻片上，另取一环菌夜与红细胞混匀涂片，干燥固定染色，显微镜下检查，如果平均每个视野是一个红细胞，10个细菌，那么，被检查细胞为5000万/ mm3，1ml是500000万个细菌。估计计数法接种环直径在0、5cm，取一环细菌液，涂抹在载玻片上，大约0、51 cm2，干燥固定染色，显微镜检查，如果每个视野平均是19个细菌，菌夜含量是105-6个/ml，1099为107-8个/ml，100以上为109-10个/ml，密不可计为1010个以上/ml。红细胞计数室法：X（细菌量）Y/80*400*稀释倍数*10=细菌数/ mm3，变ml乘1000。（Y是5个中方格细菌总数，乘10是计数室的高度为0、1mm，计数室1内mm2，有400个小格，有25个中格，每个中格是16个小格）。该方法多用于计数大的细菌或酵母菌、细胞。2 、比浊比色法比浊管法 含菌量与浑浊度正比，用已知菌含量的试管与标准比浊管相比，找出规律，如1亿细菌=1号比浊管颜色，10亿等10号，以后，用未知细菌液与标准管比色，得出大致细菌含量。美蓝还原褪色法：含细菌多，使美蓝褪色快。10ml牛奶，加1ml美蓝液（1/3000），37度水浴，褪色少于20分钟，细菌多于2000万/ml，20-2小时，为4002000万；2-5、5小时为50400万；5、5小时以上，为少于50万/ml，为一级牛奶；如果用于细菌苗，应先用已知细菌找出规律。3、活菌计数：原理，一个菌落是一个细菌的后代，数菌落就知道含菌量，也叫菌落形成单位CFU：colony format unite。倾注法（GB方法）：菌液10倍递减稀释，选2-3个稀释度，各取1ml于平皿，加45-50营养琼脂，37度培养，计算菌落，乘稀释倍数，即每ml细菌数。平板表面涂布法：先做好营养琼脂平板，将不同稀释度菌液0、1ml加上，玻璃棒刮匀，37度24h培养，计算菌落乘稀释度乘10=菌数/ml微量滴板法：将不同稀释度菌液，各取0、02ml滴在营养琼脂板上，一板可以滴多点，自然扩散，37度培养，计算每点菌落乘50乘稀释度=菌数/ml。 三、培养基微生物学已经学过，自己温习，重点熟悉：1、 不同微生物用不同的培养基来培养2、 注意各种营养物资浓度配比3、 调节合适的pH范围第二节 病毒的培养技术一、 病毒的复制与培养病毒为专性细胞寄生物，必须在活细胞内生存，其复制过程是：吸附，进入，脱壳，生物合成，装配和释放。微生物已经讲，自己复习。 二、病毒的动物接种增殖 （一）、病毒材料的处理 1、病毒的释放：剪碎研磨，冰冻融及超声波处理。 2、除杂菌：细菌过滤器过滤，高速离心取上清夜；其次是抗生素处理，加5001000u青霉素和链霉素，4度过夜杀菌。 （二）动物选择1) 健康动物、SPF动物；2) 未接种相应病毒疫苗动物3) 适宜年龄和体重4) 易感动物。（二） 接种方法：皮下，肌肉，静脉，腹腔，脑，胸腔等 三、鸡胚的接种 （一）鸡胚的选择1、健康的SPF鸡胚2、白壳，薄壳消毒蛋3、没免疫相应病毒疫苗4、5-7天照蛋，去无精、死胚鸡蛋5、画出气室，接种24h照蛋，定时收病毒。（二）鸡胚的接种和收获避开血管和心脏，确定接踵部位，先碘酒消毒，再酒精消毒，用三棱针或12号针头钻孔，然后可以接种。预先准备好病料，注射器，融化的石蜡。1、卵黄囊接种：用5-8天鸡胚，在气室中心，胚胎对侧刺入3cm（先用三棱针钻孔）。用于病毒，立克次氏体，衣原体接种。2、尿囊腔接种，用9-11日鸡胚，在气室边缘下2cm，避开血管，40进针0、5-1、5cm。适应鸡新城疫，鸭肝炎，鸡传染支气管炎病毒接种。3、羊膜腔接种：用10-12日鸡胚，在胚胎对侧进针，有抵抗时注入病毒。4、绒毛尿囊膜接种：选1113日鸡胚，先造人工气室，然后在人工气室内注射，适合痘病毒，疱疹病毒等。另外，还有脑，胚体，静脉接种，难度大，科研使用。不同病毒用不同接种途径，培养时间不同，收获组织也不同。（三）影响禽胚增殖病毒的因素 1、种蛋质量：要用SPF蛋，母源抗体存在，抗生素（对立克次氏体和衣原体）。 2、孵化环境：温度是37、8-38，湿度53-57%，通风，定时翻蛋。 3、接种技术：无菌操作和消毒，收获根据不同病毒，收获病毒时间不同，不要臭蛋和浑浊蛋。收获后测效价，加双抗-20保存。 四、细胞增殖病毒技术 1、细胞培养概念：利用机械、酶、化学方法使组织或单层细胞分散成单个或2-4个细胞的悬液，进行培养。(1) 原代细胞：新鲜组织制备的单细胞进行培养，一般仅可以传代3代。(2) 二倍体细胞：自继代细胞选出的也特殊生物学标志的细胞，染色体是二倍体，可传代50-100代，主要做疫苗生产。(3) 传代细胞：非二倍体，多为癌细胞，可无限生长，如Hela细胞，多用做病毒研究，不能做疫苗生产。2、细胞培养的方法(1) 静止培养：细胞悬液接入培养瓶中，密封置温箱培养，细胞沿瓶子壁长成单层，为最简单培养病毒方法。(2) 转瓶培养：细胞悬液在转瓶旋转培养，10-20转/h，细胞贴壁生长，需要营养液少。(3) 悬浮培养：通过震荡，转动使细胞悬浮于液体中培养。(4) 微载体培养：以固体小颗粒为载体，便于细胞附着，载体扩大了表面积。(5) 中空纤维培养：细胞在中空纤维内生长。(6) 微囊化培养：细胞在微囊中生长。3、细胞的制备细胞间有胶原蛋白，要破坏它们才变成分散单细胞。1) 机械分散：将组织剪碎成1mm3小块，再挤压通过铜丝网孔，可得到单细胞。2) 酶消化法：常用胰酶破坏细胞间质，活力1：250，浓度是0、25%，pH7、4-7、6。3) 鳌合剂分散法：EDTA可除去维护细胞间结合的Ga+和Mg+，常用于单层细胞的分散。4、 细胞培养的要素(1) 营养物资：培养液（含氨基酸，犊牛血清，维生素，盐，糖等成分）。现多用成品细胞培养基，engle液，RPMI-1640和DMEM等。(2) 接种量：与单细胞生长成正比，量过大，因细胞碎片产生毒性作用，过小，不易长成单层。不同细胞有不同接种量，如鼠肾细胞50万/ml，鸡成纤维细胞2040万ml，猪肾细胞80万/ml，血球计数室计数。(3) pH、温度、气体环境：pH7、2-7、4，不低于6、8，不高于7、6；温度一般是37，过高容易死亡，过低生长慢，20-25，细胞缓慢长。气体环境，一是橡皮塞蜜蜂培养；二是CO2培养箱培养。 5、污染问题： 细菌、真菌、支原体污染，加一定量抗生素可杀菌，如加青链霉素100u，有霉菌污染加制霉菌素。 病毒污染：有组织代毒和培养带毒，前者用SPF动物组织可以解决，后者注意灭菌和消毒。 胶原虫：（存在犊牛血清），血清37培养1个月以上，高速离心，检查沉淀物。5、 病毒增殖技术(1) 选敏感动物细胞。(2) 注意营养，温度和pH。(3) 接种量和方法：1-10%接种，V/V；分同步和异步接种。(4) 支原体污染，加抗生素。(5) 细胞病变：CPE，有圆缩、聚合、合胞体、包涵体，轻微病变，以及无细胞病变。(6) 收获：CPE到80%收获，反复冻融，离心取上清夜，测效价，加双抗，-20保存。思考题：1. 细菌规模化培养方法有哪些？2.细菌计数技术有哪些？3.用动物培养病毒时，如何选择动物？4.用鸡胚培养病毒的接种方法有哪些？如何收获病毒？5.细胞培养的方法有哪些？6.细胞培养病毒需要哪些条件第三章 灭活剂、冻干保护剂、与免疫佐剂第一节 灭活剂一、灭活与灭活剂（一）灭活：杀死病原微生物，但不影响免疫原性；其次是破坏血清的补体，以免干扰血清学反应结果。 灭活剂：灭活微生物的化学试剂。（二） 灭活方法：物理灭活：加热、及射线灭活微生物，此方法免疫原性易破坏，现很少使用（血清56C半小时灭活补体用此方法）。 化学灭活：用化学试剂将病原微生物杀死，此方法经常使用。二、常用的灭活剂种类和原理（一）甲醛：是最古老常用的灭活剂，现在我国用的26种灭活疫苗，均以甲醛为灭活剂。 性质：甲醛为刺鼻的气体，水溶液叫福尔马林，浓度为36%-40%。10C以下易聚合成三聚甲醛或多聚甲醛，为白色沉淀。 原理：甲醛的醛基起灭活作用，可使 蛋白质的氨基羟甲基胺 羧基亚甲基二醇单酯 羟基羟甲基酚 巯基硫代亚甲基二醇 浓度：需氧菌甲醛浓度到0、1%-0、2%，厌氧菌0、4%-0、8%，病毒0、05%-0、4%，原则是浓度低，时间短，温度低可以灭活细菌，尽量减少破坏抗原（通常加入量，以福尔马林量计算，不再折合甲醛浓度）。（二）烷化剂：将烷基引入，形成烷基取代物，使微生物变性死亡。原理：主要破坏病毒的核酸，作用于A：G碱基，引起DNA单链断裂或双链铰连。此类常用于病毒灭活，种类有AEIN-乙酰乙烯亚胺，加入浓度到0、05%。BEI二乙烯亚胺，浓度0、02%；EEI2乙基乙烯亚胺，GDA缩水甘油醛。 灭活后加硫代硫酸钠可终止灭活，防止抗原损失。 保存：AEI，0-4C一年，-20C二年；BEI 0-4C保存一个月。（三）苯酚（石碳酸）人类用的 第一个消毒药，具有特殊气味的无色结晶，易潮解成水溶液，与光、氧后颜色变紫色。原理：蛋白质变性以及抑制氧化脱氢酶，芽孢和病毒对它抵抗力强。灭活浓度：抑菌作用是0、20、5%（血清防腐），杀菌是1%，杀葡萄球菌是3%。消毒常用它的衍生物，来苏儿（甲酚皂）35%浓度，特殊气味，覆盖其他气味，也是医院常用的。（四）结晶紫（龙胆紫），也叫紫药水，碱性染料，也叫甲紫或甲基青莲，化学名，六甲基副玫瑰苯胺。原理：碱性阳离子可结合细菌阴离子羧基；干扰细胞壁粘肽合成；常作用于革兰氏阳性菌。生物制品的应用有猪瘟结晶紫疫苗，鸡白痢染色抗原。（五）丙酰内酯 良好病毒灭活剂，性状是无色有气味液体，易潮解和高温失效，5C密封保存好，现主要用于狂犬灭活苗。三、影响灭活作用的因素（一）药物的特异性：酚类不能杀灭真菌和病毒，阳离子的结晶紫，主要作用于G+菌。（二）微生物的种类和特异性：G+菌和G-菌对药物敏感不一样，繁殖体和芽孢对药物敏感也不一样。（三）药物浓度：浓度愈大，灭活越快，抗原也损失大；但是，95%酒精没75%酒精杀灭细菌好。（四）温度：温度与灭活成正比，每升高10度，金属类杀菌作用增加25倍。但高温超过40C，抗原也损失大。（五）时间：灭活时间与温度和浓度成反比，即灭活杀菌 长，温度旧低，浓度也 低，就可以杀灭细菌。（六）pH：碱性快，酸性慢，酸性环境对 抗原保护好。（七）有机物存在：环境的 有机物减低灭活的效果，微生物也是有机物。四、灭活疫苗时的注意事项 1、2人参加灭活，注意药品名和量，灭活后标记。 2、37C灭活一天后，接种适宜培养基无菌检查。 3、动物试验，灭活苗制成后，注射小白鼠0、2ml，两只，观察3天。 4、使用试验：用户可先注射1-2头，观察12天，看有无过敏，应激等反应，证明安全，才全群使用。思考题：1、什么叫灭活和灭火剂？2、灭活剂的种类有哪些？3、 影响灭活的因素是什么？4、 灭活的注意事项有哪些？第二节 冻干保护剂冻干保护剂也叫稳定剂，是防止微生物在冻干过程中受到破坏。A、 按作用原理分两类：渗透剂：能渗入细胞，使胞内外渗透压平衡，防止慢冻时损伤细胞。有甘油，蔗糖，而甲基亚砜。非渗透剂：防止细胞内外物质交换在速冻时保护细胞。有 蛋白质，聚乙烯吡咯酮。B、 按保护剂分子量分类：低分子量保护剂：糖、氨基酸类。高分子量保护剂：脱脂牛奶、明胶。C、 按化学性质分类：复合物：脱脂牛奶，血清。糖类：蔗糖、乳糖。盐类：乳酸钙、谷氨酸钠。醇类：甘油，山梨醇，甘露醇。酸类：柠檬酸，氨基酸。聚合物：葡聚糖，聚乙烯吡咯酮。一、冻干保护剂的组成和作用按组成将保护剂分为营养液，赋形剂，抗氧化剂。营养液：使受损细胞修复：脱脂牛奶，蛋白质，氨基酸，糖类。赋形剂：骨架作用，制品形成网孔结构，易溶解-蔗糖，乳糖。抗氧化剂：保护酶类，防止氧化VC，VE，硫代硫酸钠。保护剂的作用：1) 防止细胞内水结晶和细胞失去水分。2) 平衡细胞内外渗透压，防止细胞破裂。3) 助于细胞修复以及冻干后复苏。 二、影响冻干保护剂效果的因素 判断保护剂的好坏，从冻干后的存活率，以及生物制品的保质期研究。然后对不同物质筛选不同配方，选出好的保护剂。 1、保护剂的种类：不同微生物用不同的保护剂。 2、保护剂的浓度：510%的葡萄糖保存大肠杆菌存活率高。 3、保护剂配制方法：糖、血清、维生素不能高温灭菌，糖可以114C30分钟灭菌，其他可以过滤除菌。 4、保护剂的pH：一般为6-8。 三、常用的冻干保护剂 生物制品保护剂很多，各国家不同，如鸡新城疫苗（ND），我国是5%蔗糖脱脂牛奶；日本是5%乳糖、0、15%聚乙烯吡咯酮、1%马血清。(一) 不同微生物用不同保护剂细菌疫苗：10%蔗糖；5%蔗糖脱脂牛奶；5%蔗糖、1、5%明胶；10-20%脱脂牛奶。厌氧菌苗：0、1%谷氨酸钠、10%乳糖；10%脱脂牛奶；7、5%葡萄糖血清。病毒疫苗：多用混合保护剂，如5%蔗糖脱脂牛奶。（三） 几种常用的保护剂5%蔗糖脱脂牛奶新城疫疫苗明胶蔗糖保护剂-禽霍乱疫苗聚乙烯吡咯酮乳糖厌氧菌SPGA（蔗糖76、62g，磷酸二氢钾0、52g，磷酸氢二钾1、62g，谷氨酸钠0、83g，牛血清蛋白10g，去离子水1000ml）鸡马立克氏疫苗。保护剂的添加：一般是疫苗和保护剂1：1加入（5%蔗糖脱脂牛奶新城疫疫苗），还有是按疫苗量加入保护剂到规定浓度（如5%蔗糖明胶保护剂，加疫苗是先配浓度高的40%的蔗糖、12%明胶，然后按疫苗1份，保护剂7份混合。）。弱毒疫苗饮水：加0、2%奶粉，以中和水中的 有害离子和毒性物质。思考题：1、 什么叫冻干保护剂？组成和作用是什么？2、 影响冻干保护剂效果的因素有哪些？3、 常用冻干保护剂有哪些？第三节 免疫佐剂一、佐剂的概念：概念：adjuvant一词来源于拉丁语，即辅佐之意。免疫佐剂是一种非特异免疫增强剂，先注射或和抗原同时注射，能明显增强免疫反应。最新概念：凡是增强抗原特异性免疫反应的物质，均叫佐剂。作用机理：1、 抗原递程助于吞噬细胞的吞噬和抗原传递。2、 抗原寻找增加抗原目标，改变抗原构型，吸引吞噬细胞。3、 免疫调节增强免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫。佐剂的分类：按物理性质：颗粒型佐剂，非颗粒佐剂。按生物学性质：微生物和非微生物佐剂。按存储时间：储存型和非存储型。（一）颗粒型佐剂将抗原包括成颗粒状。1、盐类佐剂氢氧化铝胶，明矾，磷酸三钙等。2、油类佐剂A、弗氏佐剂：1935年，美籍匈牙利学者Freund发明，分弗氏不完全佐剂：矿物油75-85%+加羊毛脂（乳化剂）1525%，充分乳化即成，简写FIA,Freunds incomplete advuant；弗氏完全佐剂：是在FIA中加入死结核杆菌或卡介苗即成，缩写FCA.。B、矿物油司本佐剂（现在经常用的，以后专讲）3、免疫刺激复合物佐剂简写ISCOM佐剂（皂苷类）。4、蜂胶佐剂5、脂质体佐剂其它佐剂MF59，微胶囊佐剂。（二）非颗粒佐剂1、肽类佐剂：胞壁酰二肽（结核杆菌细胞壁），脂肽及免疫调节多肽。2、表面活性剂：海藻糖合成的衍生物。3、核酸类：合成核苷酸聚合体，次黄嘌呤衍生物，免疫刺激序列DNA。4、含硫复合物：左旋咪唑（既可驱虫，又可免疫增强）。5、高分子碳水化合物，香菇多糖。6、细胞因子：IL1、2、4；干扰素，转移因子等。8、其它，霍乱毒素，类毒素。二、常规免疫佐剂（一）盐类佐剂 1926年Gleny使用铝胶佐剂，几十年来，人畜疫苗已经广泛使用该佐剂。 作用机理：a，储存和延缓吸收；b、增加抗原表面积；c、形成巨噬细胞肉芽肿（增强体液和细胞免疫）。 1、氢氧化铝胶合成方法：有三种，铝粉加烧碱；明矾加碳酸钠以及明矾加氨水等。明矾加氨水方法：20%澄清的明矾水，温度60度，边搅边加氨水，到pH8时停止，然后打磨均匀，清水漂洗多次硫酸根离子，到pH7时既可，装瓶高压灭菌，用时20%加入疫苗。2、明矾：有钾明矾和胺明矾，主要是吸附、沉淀、浓缩作用；精致10%明矾水，灭菌，25度保存，按疫苗量12%加入，摇匀即可，有沉淀作用。主要用于破伤风类毒素的沉淀和气肿疽灭活疫苗的使用。3、磷酸三钙佐剂，与铝胶同样作用，制作简便。将灭菌的20%氯化钙2、5ml加入100ml疫苗中摇匀，再加入20%磷酸氢二钠7、5ml，摇匀即成白色絮状沉淀。加的次序不能错，该佐剂沉淀作用比铝胶强。（二）油类佐剂（矿物油司本佐剂）乳化剂是一种降低其它溶液表面张力作用的物质，可使一种物质分散混合于另一不相容的液体中。司本80或吐温80既是乳化剂。他们可使油类和水剂疫苗乳化均匀。疫苗水剂是分散相（内相）,油类为连续相（外相），两者中间是乳化剂，可以做成油包水，W/O；也可以做成水包油，O/W;前者不易吸收，储存时间长。后者容易吸收和释放。最常用是白油司本佐剂方法：制备油相：94%杭州10号白油，加6%司本80（HLB，亲水亲油值，值高亲水强，值低亲油强），HLB是4、2，混合后加2%硬质酸铝，熬化溶解，高压灭菌备用。水相：疫苗加4%吐温80（HLB 15）搅拌均匀即成。按油：水，31：1进行高速搅拌或胶体磨磨3遍就成。如果搅拌油中慢慢加入水相，制成是油包水，W/O，反之是水包油，O/W。油乳疫苗检验：1、粘度检测：口径1、2mm吸管，吸1ml乳剂，放出0、4ml的时间在26秒为宜，不可多于1015秒，注射困难。2、稳定性检查：加速老化试验，37度，1030天，不破乳；离心3000转/分钟，15分钟不分层，可以保存一年。 （三）蜂胶佐剂1、蜂胶的理化特性：蜂胶含树脂、蜂分泌物，蜂蜡、花粉及其它多种物质，为固体粘稠状，冷硬热软，灰褐色，20-40度发粘，15度下变硬脆，60-70度液化。等级：乙醇溶解后测含量，含66-70%为一级；61-65%为二级；56-60%三级；50-55%是四级。方法：2、5克蜂胶，加乙醇冷浸24h，滤纸过滤，45度干燥，计算浸出物的含量。2、作用：抗菌抗病毒、抗肿瘤、消炎和免疫增强作用。3、蜂胶的使用蜂胶处理：4-8度粉碎，过筛，1：4加入乙醇浸泡24-48h，过滤去渣，算出含量，4度保存。蜂胶的加入：一般按疫苗量的到10mg/ml，摇匀成乳浊状。山东滨州兽医研究所 生产蜂胶系列疫苗。三、新型免疫佐剂（一）细胞因子类佐剂IL -1:淋巴细胞活化因子，活化多种免疫细胞IL-2：T细胞生长因子，也促进B细胞增殖，应用多。IL-4：B细胞刺激因子IL-12：B细胞产生的，促进淋巴细胞成熟干扰素：抗病毒，抗肿瘤，免疫调节。（二）免疫刺激复合物（iscom） 是抗原：皂苷：胆固醇=1：1：1制成，为脂质效泡，作用，提高抗原传递，可与多种疫苗混合，还可以粘膜免疫。（三）脂质体 人工合成多层脂质小体，包埋抗原，提高抗原传递。（四）MF59佐剂 4、3%角鲨烷+0、5%吐温80+0、5%司本85组成，多用于病毒疫苗佐剂，可刺激体液免疫也可以细胞免疫。思考题：1、 什么叫佐剂？作用原理是什么？2、 佐剂按物理性质，可分为哪些种类？3、 什么叫弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂？4、 什么叫细胞因子？又和特点？主要有哪些？5、 常规佐剂有哪些？新型佐剂有哪些？6、 铝胶和司本油类佐剂如何配制？第四章 菌（毒）种选育技术及疫苗制备技术第一节 菌（毒）种选育技术一、兽用生物制品菌（毒）种的标准1、 生物学性状明显，历史清楚：形态、生理、生化典型、血清学、来源、代数等清楚。2、 遗传学纯一稳定：稳定纯一的菌种，才能制造出高质量稳定的疫苗。3、 免疫抗原、反应抗原好：高质量疫苗的基础。4、 毒力在适当范围内：灭活疫苗应该是强毒，弱毒疫苗安全，中等毒力的如ND-I系，IBD中等毒力苗。测定毒力要用敏感动物进行。二、强菌（毒）种的选育1、强毒种的用途：灭活疫苗、诊断试剂、抗血清、攻毒试验。2、强毒种来源：典型传染病分离培养，保藏中心提供。3、强毒种分离：a、纯粹试验（分离培养、鉴定）。 B、致病力（动物、鸡胚、细胞试验）。 C、抗原性（免疫及反应抗原试验） D、稳定性（传代不变异）达到：毒力强，纯粹，抗原好，稳定的菌种，最后冻干保藏。这就是强毒菌种的标准复壮：弱毒菌种在敏感动物或细胞上多次传代，达到毒力增强的目的（日本731部队用人试验，目的是增强细菌毒力，做细菌武器使用。）。三、弱（菌）毒种的选育1、用途：弱毒疫苗，诊断试剂，免疫血清。2、来源：自然界筛选和人工诱变。3、弱毒筛选途径：自然界弱毒筛选：同源弱毒新城疫I系 异源弱毒火鸡疱疹病毒疫苗 它们都是在自然界寻找发现的。人工诱变筛选：化学诱变：洗衣粉、锥黄素、醋酸铊等加入培养基。 物理诱变：高温培养，干燥，紫外线等。 生物诱变：通过钝感动物，细胞以及细胞培养获得。4、初选的依据：a) 生物性状改变猪丹毒杆菌变长丝状，菌落光滑变粗糙。b) 病毒蚀斑变异。c) 温度敏感变异。d) 药物敏感变异e) 营养变异f) 宿主变异第二节 细菌性疫苗和类毒素的制备技术 制造优良疫苗的关键：a、优良的菌种，b、适宜的培养方法；c、良好生产工艺；d、严格的检验和标准。一、细菌性灭活疫苗的制备程序1、种子：毒力强，免疫原性好，13个菌株，菌种逐级扩大培养。2、培养：选适当培养基和方法，如固体或液体培养，要计数活菌和观察纯度。3、灭活和无菌检查：加适量甲醛37度灭活24h，接种斜面培养基无菌检查，4、浓缩提高含菌量：离心或沉淀方法。5、配佐剂分装：加20%铝胶，或油2：1水油乳化，无菌分装，加塞，封蜡，标签和装箱。6、动物安全试验，接种小白鼠0、2ml观察3天，健活。二、细菌性活疫苗的制备程序 1、菌种：中监所提供冻干种。 2、培养：1-3%量接种，检查纯度和计数。 3、浓缩：离心或吸附沉淀法（用0、2-0、25%羧甲基纤维素浓缩。 4、配苗和冻干：加入合适浓度保护剂，分装，冻干，加塞，封口，标签和装箱。 5、动物安全试验。三、类毒素的制备程序 1、菌种与毒素 中监所分发或批准的产毒效价高、免疫力强的菌株，必要时可对菌种进行帅选。 2、脱毒 甲醛溶液法 3、类毒素的精制 （1）物理学方法 冷冻干燥、超滤、蒸发、冻融等 （2）化学沉淀法 酸沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等 （3）层析法 凝胶过滤、离子交换层析法第三节 病毒疫苗的制备技术一、病毒性组织苗的制备程序 病毒在易感动物体内增殖，用含毒量高的组织制造疫苗，叫灭活组织苗，如兔瘟，自家组织灭活苗；弱毒疫苗有猪瘟兔化弱毒疫苗。 （一）自家组织灭活苗 1、选症状典型、含毒量高的组织。 2、称重和打匀：一般按组织和生理盐水按1：58打匀。切碎组织，捣碎机打匀，1：5加生理盐水，加青链霉素各1000u/ml。 3、冻融和过滤：冰柜反复冰冻和融化三次，释放病毒，4层纱布过滤。 4、灭活：加0、4%甲醛灭活，37度24h， 5、无菌检查：接种斜面培养基，培养24h，无细菌生长。菌苗4层纱布再过滤一次。 6、加佐剂分装：加20%铝胶，分装。 7、动物安全检查:接种小白鼠0、2ml，观察3天，无反应，安全。 （二）病毒弱毒疫苗1. 选易感的SPF动物，年龄大小一致。2. 毒种：选适宜毒力的病毒，减少传代次数，选适宜接种途径。3. 观察、收获和测效价：观察食欲、体温、精神等，符合症状者剖杀，取含度高组织测效价，符合效价可以做疫苗。4. 研磨、稀释和杀菌：将组织剪碎研磨，按1：101：100加入稀释剂，过滤，1双抗500-1000u/ml，0-4度处理过夜。5. 无菌检查，半成品疫苗接种适宜培养基培养，无细菌生长。6. 加保护剂冻干分装。7. 动物安全试验，接种适宜动物，3天安全。二、病毒性禽胚培养疫苗的制备程序 除禽病可以用禽胚外，其它正粘病毒（流感）、副粘病毒等，都可以用禽胚培养，生产工艺简单，质量容易控制。（一） 鸡胚的选择：SPF、未免疫、未用抗生素，适宜的鸡胚龄。（二） 种毒和继代：冻干毒要鸡胚活化三代以上，效价合格方可使用。（三） 接种与收获接种，合适部位、合适时间，适宜浓度和量，如ND 系，为10-3 、1ml接种。ND 系是用10-4 、1ml接种.培育及收获：ND系，为38、5-39,60-70%湿度培育，收24-48h的鸡胚，0-4冷却，收尿囊液。（四） 检查无菌和效价。ND ND系效价是1：80以上合格。（五） 配疫苗：1. 湿疫苗：尿囊液加双抗，-20保存1-2年，0-8保存3-6个月。用时按10-4稀释，每鸡一滴。2. 冻干疫苗：尿囊液适当稀释10-2，加等量保护剂，双抗，分装冻干，-15一年保存。3. 油乳灭活疫苗：尿囊液适当稀释10-2，加0、1%甲醛灭活，加双抗，按油：水疫苗，3-1：1乳化即成，3-15度保存半年，小鸡0、1-0、2ml，大鸡0、51ml。三、病毒性细胞培养疫苗的制备程序(一)种毒和继代：毒种要经过毒力、安全、无菌检查合格才可以做毒种。其次，毒种要细胞适应后可以大规模培养。（二）营养液：多用专门商品培养基。（三）细胞制备：多用原代细胞和二倍体细胞