植物种质的玻璃化超低温保存.doc

植物种质的玻璃化超低温保存日胞生物学杂志ChineseJournalofCellBiology2005,27:4345http:/www.cjcb,org植物种质的玻璃化超低温保存梁宏王起华(辽宁师范大学生命科学学院,大连116029)摘要植物种质的玻璃化超低温保存技术已受到广泛重视.玻璃化法主要由装载,玻璃化保护液脱水,降温,复温,洗涤这5个环节构成.目前已对百余种植物进行过玻璃化冻存研究,但主要应用于高等植物,而用该法保存藻类获得成功的报道很少.将玻璃化法用于某些藻类种质的冻存将会有广阔的应用前景.关键词植物种质;超低温保存;玻璃化超低温保存是目前植物种质资源长期稳定保存的理想方法.在超低温(通常指液氮温度,一196)条件下,细胞的全部代谢活动近于完全停止,因而可以保持种质的遗传稳定性,达到长期保存的目的.自从1973年Nag等首次成功地超低温保存了胡萝卜悬浮细胞以来,国内外已对近200种植物材料进行了超低温保存【2】,所采用的方法主要包括两步法,玻璃化法和包埋一脱水法.其中,玻璃化法是2O世纪8O年代才发展起来并日益受到广泛重视的超低温保存新技术.所谓”玻璃化”就是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中,使细胞及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下过冷到玻璃化转变温度,而被固化成玻璃态(或非晶态),并以这种玻璃态在低温下保存【41.与传统的超低温保存方法相比,玻璃化法操作简单,重演性好,避免了一些种质的冷敏感问题,并且在复杂的组织和器官的超低温保存方面有较好的应用潜力【5】.但是玻璃化溶液对细胞具有一定的毒性,复温后其残余会造成再培养过程中一部分细胞的死亡.Steponkust1,TowillI1及严庆丰等71曾就玻璃化法的研究进展作过论述,王君晖等IS也曾就玻璃化法在园艺作物茎尖和分生组织的超低温保存中的应用价值方面作过报道.近几年来,植物种质玻璃化法超低温保存的研究又有了重大进展.1玻璃化冻存植物材料已取得的成果1985年Rall等91第一次运用玻璃化法成功保存小鼠胚胎,证明了这项技术的可行性.1989年Langis等【lo】和Uragami等】相继证实了玻璃化法冻存植物材料同样是可行的.近I5年来,已成功地应用该法对IO0余种植物材料进行了超低温保存12I.冻存材料包括植物茎尖,原生质体,分生组织,合子胚,细胞等.表I列举了近10年来部分植物材料的实验结果2,12-331,有关1994年以前的研究报道可参见严庆丰等的文章71.另外,Stillinger等341就超速冷却的液体和玻璃化的形成进行了探讨.董轶锋等【35】对若干常用的低温保护剂实现玻璃化转变的临界降温速率进行了实验确定,并修正了临界降温速率的公式.Wang等【361对玻璃化冻存后的水稻胚胎悬浮细胞的内部结构及其机制进行了探讨.2玻璃化冻存法的主要过程本文重点论述植物材料玻璃化冻存方法的5个主要环节:(1)装载;(2)玻璃化保护液脱水;(3)降温;(4)复温;(5)洗涤【51.对材料冻存后的再培养和存活率测定等内容则不做论述.2.1装载研究表明,若用玻璃化溶液对抗脱水性较差的细胞或茎尖直接进行处理,则会因为玻璃化溶液的渗透压力和化学毒性作用对其造成伤害【241.但若是在用玻璃化溶液对材料进行处理前,有一个装载的过程,即用一个较高浓度的冷冻保护剂混合液于室温下预处理一定时间,进一步降低组织含水量,则可避免由于渗透压变化剧烈对材料造成的伤害【lSl.装载溶液多采用2mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖的混合液15,16,19.22,24,25,28:1,也有的采用稀释的玻璃化溶液2,13.1引.但有些材料,如柿休眠茎尖,则不需要装载处理221.可见,在实验中是否需要装载这一步骤要根据材料的具体生理特性来决定.另外,某些实验中,在对材料进行玻璃化冻收稿日期:200406.07接受日期:2004.09.17国家自然科学基金(No.30470184.No.30170099)资助项目通讯作者.TelEmail:qihua_PVS2:30%甘油+l5%EG+l5%DMSO+0.4mol/L蔗糖;EG:乙二醇;DMSO-二甲基亚砜;I:一步法;II:悬滴法与一步法结合;III:用半固体氮降温存前,通常用低浓度的冷冻保护剂进行预培养51.预培养的目的是使材料脱水,增加含糖量和提高细胞膜在严重脱水条件下的稳定性【l6】.颅培养的方式依材料的不同而不同.多数是在含有0.3mol/L蔗糖的培养基中425培养1672htll,I420221.也有采用5%二甲基亚砜I,3】或双预培养I271对材料进行处理的报道.但Hirai等的实验发现,预培养使得包埋一玻璃化冻存后的薄荷分生组织的成苗率显着下降.2.2玻璃化保护液脱水从理论上来说,玻璃化状态没有冰晶产生,不存在对组织和细胞的机械损伤和溶液效应.正确的保护剂处理必须保证细胞充分脱水,同时又防止化学毒害和渗透压所造成的细胞伤害【7】.Towillt6曾建议采用逐步增加玻璃化溶液浓度对材料进行多步处理的方法,但大多数研究采用一步处理方法【215.16621,31.至于到底采取何种保护剂添加方法可能还要考虑材料的种类和生理状态【7l.另一方面,对于不同的组织和细胞,所要求的保护剂处理时问和温度也不同.一般为0或25处理5,-,60mint12.15.保护剂处理时间过短,材料脱水不够,在降温过程中不能迅速达到玻璃化状态,因而不易成活;处理时间过长,材料由于受玻璃化溶液的毒害,成活率反而又有所降低,1.同时,合适的脱水时问还要根据细胞膜特性,细胞大小,细胞的耐脱水性以及玻璃化溶液对细胞的渗透性等因素来综合考虑【l4】.2.3降温玻璃化超低温保存要求通过快速的降温来达到玻璃化转变所需的温度.通常是采用一步法快速投入液氮来达到所需的降温速率(表1).Towillt61I,I是先将材料在一160的氮蒸汽中悬浮30min,再将其投入液氮中.Pennycooke等t24ll用箔条包裹材料,置于半固体的氮中来快速降温.Halmagyi等I201则采用悬滴法和玻璃化法结合的方法,即将含有材料的玻璃化溶液滴于薄铝片上,再投入液氮中来提高降温速率.2.4复温处于玻璃化状态的细胞质常有微小冰核存在,化冻时随着温度升高,可能因热容改变而发生去玻璃化.因此,成功的玻璃化保存除了在降温冷却过程中要避免结晶固化,还应在复温加热过程中避免去玻璃化【4l.一般是在40左右的水浴中快速化冻【7】.2.5洗涤不同于常规的超低温保存,在玻璃化冻存中,梁宏等:植物种质的玻璃化超低温保存45由于保护剂的浓度很高,化冻后的洗涤被认为是重要的.一般采用高渗的培养基洗去样品中的保护剂成分,以减轻细胞的去质壁分离损伤.较常用的是含1.2mol/L蔗糖的培养基16?22283H,也有的采用含1.2mol/L山梨醇的培养基【22.6玻璃化法与包埋法的结合21】采用包埋一玻璃化法已成功地保存了多种植物材料,包括分生组织【28,830?,引,茎尖【l2】等.该法结合包埋脱水法和玻璃化法的优点于一身,操作简便,并可同时对大量材料进行处理;而且,与包埋脱水法相比,冻存后材料再生较早,存活率也较高【28】.因此在植物种质的超低温保存中有较好的发展前景.3玻璃化冻存法的应用前景采用玻璃化法保存植物材料,不仅简单,快速,有效,而且在保存器官和组织的结构完整等方面更有其独特之处.另外,玻璃化法不仅可以成功地对植物茎尖,分生组织,体细胞胚,悬浮细胞,原生质体等进行超低温保存,而且还能够用于植物病毒的去除【37】.但与常规的冷冻保存方法相比,目前采用玻璃化法保存的植物种类要少的多,而且主要限制在高等植物范围内,对于种类繁多,形态各异的藻类的超低温保存,目前仍主要采用常规的两步冷冻法.近年来对少数藻类已开始探讨用包埋一脱水法保存,并取得了一些进展【38】,我们应用包埋法已成功地保存了坛紫菜自由丝状体【39】和牟氏角刺藻【40】.但采用玻璃化法成功保存藻类的报道很少172332.通过借鉴高等植物玻璃化冻存的方法和经验,应用玻璃化法对藻类种质进行超低温保存可能会有很大的应用潜力.【1】【2】【3】【4】【5】【6】【24】【25】【26】【27】【28】【29】【30】【31】【32】【33】【34】【35】【36】【37】【38】【39】【40】参考文献(References)NagKKela1.Nature,l973,245:270陈勇等.矗棚理奶,2002,29:94ShibliRAela1.PlantCP,Rep.2001.20:4_45华泽钊等生物医技尤北京:科学出版社,l994.70SteponkusPLela1.AdvancesfnLowTemperatureBiology,VolumeI,London:JAIPress.1992.1TowillLE.Cryopreservationbyvitrification.In:GroutB(ed.1GeneticPreservationofPlantCellsinVitro,Berlin,Heiclelberg,NewYork:Springer,l995.99严庆丰等.缅馏生象矗l994.16:l17王君晖等.识l994,21:277RallWFela1.Nature,l985,313:573LangisRela1.Cryoletters.1989.10:421UragamiAela1.PlantCP,Rep.1989.8:4l8HiraiDela1.PlantCP,Rep.2003.21:96l张玉进等.纺摄200l,27:97胡明珏等.细胞生物杂,2004,26:8lVandenbusscheBPf,.PlantCP,Rep,2000,l9:l064IshikawaKela1.PlantCellRep,l997,l6:754项黎新等.留胞生物象啬,200l,23:ll0王子成等.学,200l,28:30lTakagiHela1.PlantCellRep,l997,l6:594HalmagyiAela1.PlantCellRep,2004,22:37l陈舅等浙江大学t农业s生命科学版l.2响,27:436艾鹏飞等.农业2003,36:553DavJG.Conservationstrategiesforalgae.In:BensonE(ed.)PntConservationBiotechnologY.London:Taylor&Francis,l999.1llPennycookeJC,.PlantCellRep.2000,19:733MatsumotoTela1.PntCellTissueOrganCult.1995.41:237WuYJa1.CryoLetters.2003,24:303云国等山东农业大学t自然科学版l,200233:32HiraiDela1.PlantCellRep,l999,l9:l50王君晖等实验生物毒l999,32:27lTouchellDH.PlantCP,Rep,2002.21:ll8SharmaNela1.CryoLetters.2003,24:l8lLiuHQeta1.PlantSci,2004,166:97MatsumotoTela1.CryoLetters.1995.16:l89StillingerFHela1.Science,l995,267:l935董轶锋等.工2003,132:47WangJH,.CryoLetters.1998,19:49HelliotBela1.PlantCP,Rep,2002,20:lll7王起华等暂物斌掇2002,19:2l王起导等辽宁师范大学(自然科学版1200023:387李莹等.蓐2003,27:48TheCryopreservationofPlantGermplasmbyVitrificationHongLiang,QiHuaWang(SchoolofLifeScience,LiaoningNormalUniversity,Dalian116029,China)AbstractCryopreservationofplantgermplasmbyvitrificationtechniquehasbeenappreciatedextensivelytodate.Vitrificationmethodconsistsof5stepsmainly:loading,dehydrationbyprotectivesolutionofvitrification,cooling,warmingandwashing(namelyunloading).Therearehundredsofspeciesofplantsbeingcryopreservedbythismethodintheworlduptonow,butmainlyofspeciesofhigherplants.However,fewsuccessfulstudiesonthecryopreservationofalgaegermplasmbyvitrificationtechniquehavebeenreportedsofar.Applyingvitrificationtechniquetocryopreservationofsomespec