第章-维生素的测定PPT课件

Vitamin的一般知识,一、共同特点：大多不能在体内合成（可少量合成）大多不能大量储存于组织中不构成组织的原料不提供能量以辅酶或辅基形式参与酶反应,二、命名与分类,以字母、化学结构或功能命名VitaminA/视黄醇/干眼病维生素,分类：脂溶性、水溶性,三、维生素缺乏,临床缺乏亚临床缺乏(marginaldeficiency)降低对疾病的抵抗力、降低工作效率和生活质量。,脂溶性维生素主要储存在肝脏中，摄取过多，可能会引起中毒。摄取过少，可缓慢出现缺乏症状。水溶性的呢？,第一节概述,一、vitamin含量和测定意义1含量分布：VA0.1-300mg/100g鱼肝-胡萝卜素0.1-12mg/100g果蔬Vc0.1-1000mg/100gVB的含量较低,2测定意义,A利用性：人体需要、合理膳食B贮存C加工,二、维生素分析工作的特点,1个别测定。无所谓总量2稳定性差，光、热、氧、酶敏感3干扰杂质多4结合态存在的问题,二、维生素分析的一般程序,1使游离出来2提取（选溶剂）3纯化（根据待测vit与杂质的性质差异）4测定,维生素分析的方法有化学法(比色法、滴定法）仪器法（紫外法、荧光法）微生物法(水溶性维生素、B2）生物鉴定法(VD),第二节水溶性维生素的测定,水溶性维生素的性质样品预处理,.,14,一、维生素B2的测定,在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式。是机体许多重要辅酶的组成成分，对机体内糖、蛋白质、脂肪代谢起着重要作用。主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。,1原理,荧光计法,核黄素在440500nm波长光照射下发出黄绿色荧光。在440nm激发波长，525nm发射波长下测定提纯液的（黄绿色）荧光强度。之后，试液中加入低亚硫酸钠(Na2S2O4)，将核黄素还原为无荧光物质，再测定残余杂质的荧光强度，荧光值之差与核黄素含量成正比。,3测定方法,(1)样品提取(2)氧化去杂质(3)核黄素的吸附和洗脱(4)荧光测定,样品经酸解、酶解处理使核黄素游离出来，用高锰酸钾和过氧化氢氧化其它色素和杂质，再经硅镁吸附剂进行柱层析，吸附提纯核黄素。,4结果计算,5说明,核黄素对光敏感，整个操作应在暗室中进行。核黄素可被低亚硫酸钠还原成无荧光型，但摇动后很快就被空气氧化成有荧光物质，所以要立即测定。,二、维生素B1,比色法硫色素荧光法液相色谱法,以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。动物组织不如植物含量丰富。,荧光计法,1原理硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，能被氧化成硫色素，在紫外光照射下产生蓝色荧光。如果不存在其它荧光物质干扰，荧光强度与硫色素含量成正比，即与溶液中硫胺素含量成正比。,4操作方法,(1)样品提取水解酶解(2)净化(3)氧化(4)荧光强度的测定,5结果计算,6说明,一般食品中的维生素B1有游离型的，也有结合型的，即与淀粉、蛋白质等结合在一起的，故需用酸和酶水解，使结合型B1成为游离型，再采用此法测定。,可在加入酸性氯化钾后停止实验，因为硫胺素在此溶液中比较稳定。,样品与铁氰化钾溶液混合后，所呈现的黄色应至少保持15秒，否则应再滴加铁氰化钾溶液12滴。,紫外线破坏硫色素，所以硫色素形成后要迅速测定，并力求避光操作。,氧化是操作的关键步骤，操作中应保持加试剂的迅速一致,三、维生素C的测定,1Vc的性质已糖醛基酸易溶于水、醇，不溶于乙醚、氯仿等干燥状态较稳定、酸性介质中较稳定对光、氧、铜离子敏感,2测定方法,(一)2，4二硝基苯肼比色法(二)2，6二氯靛酚滴定法(三)荧光法,.,37,(一)2,4二硝基苯肼比色法,1原理用活性炭（其中吸附的氧）将还原型抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，然后与2，4二硝基苯阱作用生成红色的脎。在浓硫酸的脱水作用下，可转变为桔红色的无水化合物双2，4二硝基苯。在硫酸溶液中显色稳定，最大吸收波长为500nm，吸光度与总抗坏血酸含量成正比，故可进行比色。,.,38,3测定步骤,样品提取氧化显色反应85硫酸处理比色标准曲线的绘制,.,39,4结果计算,.,40,5、说明,活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧进行界面反应，加入量过低，氧化不充分，测定结果偏低，加入量过高，对抗坏血酸有吸附作用，使结果也偏低。,.,41,对无色或已脱色样品，也可用溴液作氧化剂。还可用2，6二氯靛酚作氧化剂。,(二)2,6二氯靛酚滴定法,1、原理还原型抗坏血酸可以还原染料2，6二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色(在中性或碱性溶液中呈蓝色)，被还原后颜色消失。还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗坏血酸含量成正比。,3测定步骤,(1)提取鲜样制备干样制备(2)滴定,4结果计算,5说明,所有试剂最好用重蒸馏水配制。样品采取后，应浸泡在已知量的2草酸溶液中，以防止维生素C氧化损失。测定时整个操作过程要迅速，防止抗坏血酸被氧化。,若测动物性样品，须用10三氯醋酸代替2草酸溶液提取。若样品滤液颜色较深，影响滴定终点观察，可加入白陶土再过滤。白陶土使用前应测定回收率。若样品中含有Fe2+、Cu2+、Sn2+、亚硫酸盐、硫化硫酸盐等还原性杂质时，会使结果偏高。,.,48,第三节脂溶性维生素的测定,维生素A的测定胡萝卜素的测定维生素D的测定维生素E的测定,.,49,脂溶性维生素的理化性质,主要有下列方面：1、溶解性2、耐酸/碱性3、耐热性、耐氧化性,.,50,1、溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。,.,51,2、耐酸碱性：,维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。,.,52,3、耐热性、耐氧化性：,.,53,一、维生素A的测定,（一）概述（二）三氯化锑比色法（三）紫外分光光度法（四）高效液相色谱法,.,54,概述,.,55,.,56,.,57,测定方法三氯化锑比色法紫外分光光度法荧光法气相色谱法高效液相色谱法,.,58,三氯化锑比色法（GB第二法）,1原理在氯仿溶液中，维生素A与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，在620nm波长处有最大吸收峰，其吸光度与维生素A的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。,.,59,2适用范围及特点,本法适用于维生素A含量较高的各种样品(高于5一l0gg)，对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰，不易比色测定。,.,60,3测定方法,(1)样品处理皂化（氢氧化钾，乙醇）提取（乙醚）洗涤（水，氢氧化钾）浓缩（无水硫酸钠，三氯甲烷）,.,61,(2)标准曲线的绘制(3)样品测定,.,62,结果计算,.,63,所用氯仿中不应含有水分，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色测定。故在每m1氯仿中应加入乙酸酐1滴，以保证脱水。,说明与注意点,.,64,维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃避光。,.,65,测定结果也可以每100g食品中所含维生素A的国际单位表示，每国际单位维生素A相当于0.3g维生素A。,1g胡萝卜素=0.167g视黄醇当量。以往VA的量常用国际单位（IU）表示。1IUVA=0.33gVA=0.33g视黄醇当量。,.,66,三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上；三氯化锑遇水生成白色沉淀，因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。,.,67,比色法除用三氯化锑作显色剂外，还可用三氟乙酸、三氯乙酸作显色剂。其中三氟乙酸没有遇水发生沉淀而使溶液混浊的缺点。,.,68,(二)紫外分光光度法,1.原理维生素A的异丙醇溶液在325nm波长下有最大吸收峰，其吸光度与维生素A的含量成正比。,.,69,2适用范围及特点,本法的灵敏度较比色法高，可测定维生素A含量低于5gg的样品。主要缺点是在维生素A最大吸收波长325nm附近许多其他化合物也有吸收，干扰测定，,.,70,故本法适用于透明鱼油，维生素A的浓缩物等纯度较高的样品。对于一般样品，测定前必须先将脂肪抽提出来进行皂化，萃取其不皂化部分，再经柱层析除去干扰物。,.,71,（三）高效液相色谱法,1、原理（GB/T5009.82-2003第一法）皂化、提取样品中的维生素A和维生素E后，用高效液相色谱法C18反相柱将两者分离，用紫外检测器检测，内标法定量。,.,72,测定步骤（1）样品处理（皂化、提取、洗涤、浓缩）（2）标准曲线的制备,.,73,二、胡萝卜素的测定,450nm波长处有最大吸收HPLC法（GB/T5009.83）纸层析、柱层析薄层层析法,-胡萝卜素含有两个维生素A1的结构，称为维生素A原。,.,74,.,75,一、高效液相色谱法,1原理试样中的-胡萝卜素，用石油醚+丙酮(80+20)混合液提取，经三氧化二铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。,.,76,二、纸层析法,1原理：以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素；以石油醚为展开剂进行纸层析。胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其它色素分开。剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下进行比色，测定。,.,77,4、测定步骤,（1）样品提取与洗涤(石油醚）（2）浓缩与定容（3）纸层析（4）比色测定（5）标准曲线的绘制,.,78,点样：带状点样展开洗脱：剪下位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带，石油醚,.,79,.,80,5、结果计算,.,81,6说明与讨论,此法也为国家标准方法，方法简便，色带清晰，最小检出限为0.11g。样品和标准液的提取一定要注意避免丢失。,.,82,浓缩提取液时，一定要防止蒸干，避免胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏。定容、点样、层析后剪样点等操作环节一定要迅速。,.,83,三、维生素D的测定,.,84,.,85,.,86,7-脱氢胆固醇经光照可转变为VD3,.,87,.,88,维生素D的测定方法有：比色法、紫外分光光度法、气相色谱法、液相色谱法薄层层析法,.,89,（一）HPLC法,试样经皂化后，用苯提取不皂化物，馏去苯后，使用第一阶段的分取型HPLC，分取维生素D组分，以去除大部分干扰物质。得到的维生素D组分，用于第二阶段分析型HPLC，得样品色谱图，与按同样操作条件得到的维生素D标准品的色谱图比较进行定量。,.,90,本法对维生素D2和D3不加区别，两者混合存在时，以总维生素D定量。按国际单位，每1IU相当于0.025g维生素D。,.,91,(二)三氯化锑比色法,1、原理在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，呈色强度与维生素D的含量成正比。,.,92,3、测定步骤,(1)样品处理(2)测定,.,93,4结果计算,.,94,5说明与讨论,食品中维生素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、胆固醇，甾醇等成分的含量往往都大大超过维生素D、严重干扰维生素D的测定，因此测定前必须经过层析除去这些干扰成分。,.,95,可参考柱层析图,.,96,此法不能区分D2和D3，测定值是两者的总量。,.,97,四、维生素E的测定,.,98,.,99,.,100,.,101,.,102,测定方法,比色法荧光法GC法HPLC法（VA、VE）,.,103,（一）HPLC法（VE）,1原理试样中的维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机