【毕业学位论文】（Word原稿）绿僵菌固体培养基的微波灭菌研究微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 绿僵菌 固体培养基的微波灭菌 研究 on on I 摘 要 固体培养基灭菌通常采用 高压蒸汽灭菌 方法 ，存在灭菌时间长 、 不能实现 生产线连续生产 等问题 。本研究以枯草杆菌 黑色变种芽胞 ( 指示菌 ， 利用家用 800w 微波炉对固体培养基进行 微波 及 微波过氧化氢联合灭菌 试验 ， 研究微波灭菌的 工艺参数，评价 灭菌效果， 进行金龟子绿僵菌培养试验来探讨微波灭菌对 固 体培养 的影响， 为工业化微波灭菌提供参考。 （ 1） 固体培养基微波灭菌 微波灭菌 设 负载、水分和浸润 三个因素 ，结果表明：随负载量的增加，杀菌速度降低 ； 含水量 和浸润 显著影响灭菌效果 。 微波灭菌的最佳 条件 为： 100g 固体培养基加 60g 水，浸润 3h， 微波处理 150s。 （ 2） 固体培养基微波过氧化氢联合灭菌 微波过氧化氢联合灭菌， 设 浸润 时间 、过氧化氢浓度、料水比例、微波处理时间 4 个因素 ，选用 27）正交实验表安排实验。结果表明最佳灭菌 参数 为： 100g 固体培养基加 60g 水，过氧化氢质量分数为 浸润 3h，微波处理 90s。 （ 3） 微波 灭菌 对 固体培养 的影响 在 微波 灭菌后的固体培养基 上 接种 培养 金龟子绿僵菌，以 单位质量固体培养基中 金龟子 绿僵菌的产孢量作为检测指标， 探讨 微波灭菌对 固体培养 的影响 。 结果表明： 最佳处理工艺微波灭菌对固体培养 无影响， 绿僵菌 产孢量与 高压蒸汽灭菌 培养基 上 的产孢量无显著差异。微波处理固体培养基 120s 或 过氧化氢 质量分数 微波处理 90s， 接种培养 绿僵菌 能够 正常生长 和产孢 。 关键词 ： 金龟子绿僵菌 ， 微波灭菌 ， 过氧化氢 ， 固体培养基 t of is is t be In as by by 00w or in of or in by of is to of (1) of 00g 0g 50s (2) in of of to of in 8（ 27） 00g 0g (w/w) 0s by (3) of on as of on on no in on 20 0 in 录 第一章 绪论 . 1 僵菌的生物防治 . 1 波灭菌研究进展 . 1 波灭菌机理 . 2 波灭菌设备 . 3 波灭菌的过程控制 . 4 波灭菌与其它灭菌方式的协同作用 . 6 波灭菌应注意的问题及展望 . 8 究内容与方法 . 9 究内容与方法 . 9 术路线 . 10 究目的与意义 . 11 第二章 金龟子绿僵菌固体培养基的微波灭菌 . 12 料和方法 . 12 波炉 . 12 种及其芽胞制备 . 12 养基 . 12 菌载体制作 . 12 菌计数方法 . 13 体培养基原料细菌总数及芽胞总数测定 . 13 波炉功率的测定 . 13 波炉均匀性试验 . 13 波灭菌试验 . 14 果与分析 . 15 体培养基原料细菌总数及芽胞总数测定结果 . 15 波炉功率的测定结果 . 16 波场均匀性试验结果 . 16 同负载量的微波灭菌试验结果 . 19 同含水量的微波灭菌试验结果 . 20 润后的微波灭菌试验结果 . 21 论 . 22 第三章 金龟子绿僵菌固体培养基微波过氧化氢联合灭菌 . 24 料和方法 . 24 波炉 . 24 种及其芽胞制备 . 24 养基 . 24 菌载体制作 . 25 菌计数方法 . 25 和剂鉴定试验 . 25 过氧化氢单独灭菌试验 . 26 波过氧化氢联合灭菌 . 26 果和分析 . 26 和剂鉴定试验结果 . 26 氧化氢 单独灭菌试验结果 . 27 波过氧化氢联合灭菌试验结果 . 27 论 . 28 第四章 微波灭菌对固体培养的影响 . 30 料和方法 . 30 波炉 . 30 种及其芽胞制备 . 30 养基 . 30 菌载体的制作 . 31 波对固体培养的影响试验 . 31 位质量培养基绿僵菌的产孢量检测 . 31 养基（物）含水量的测定 . 31 果与分析 . 32 波灭菌对固体培养的影响试验结果 . 32 波过氧化氢联合灭菌对固体培养的影响试验结果 . 33 论 . 34 第五章 全文结论 . 35 附录 枯草芽胞杆菌黑色变种的生物学特性及芽胞制备 . 36 1 形态特征 . 36 2 培养特征 . 36 3 枯草杆菌的培养 . 36 参考文献 . 38 致 谢 . 43 作 者 简 历 . 44 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 铃薯葡萄糖培养基 草芽胞杆菌 酸盐缓冲液 落 计数 单位 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 僵菌的 生物 防治 绿僵菌 一种世界性分布的杀虫真菌。金龟子绿僵菌是最早用于生物防治的昆虫病原真菌，利用它来防治害虫的研究已愈百年 （ 樊美珍 ， 1993）。 近 20 年来，巴西和澳大利亚广泛使用金龟子绿僵菌防治甘蔗和牧草害虫。非洲用黄绿绿僵菌防治蝗虫的试验取得了初步成功。中国农 业科学院生防所（现在已改名为中国农业科学院 植物保护研究所 ）利用金龟子绿僵菌防治草原害虫，取得了可喜的成绩。到 2003 年为止，其防治面积已逾 200 万亩。2005 年，海南椰心叶甲大爆发。农科院植物保护研究所绿僵菌实验室利用绿僵菌防治椰心叶甲，防效显著。 绿僵菌的特性： 它能在 8 个目 30 个科 200 多种害虫上寄生，且有些菌株对林木食叶性害虫马尾松毛虫也表现出较强的毒 力 （ 宋漳 ， 2001） 。 人、畜、作物无毒害。绿僵菌杀死害虫后 ， 其孢子还可以 在害虫 体内萌发去侵染别的害虫 ， 引起流行病的发生 ，可持续有效传播来控制害虫种群密度在危害水平以下 ， 对环境无污染。所以利用它对害虫进行微生物生物防治具有广阔的前景，已被联合国粮农组织（ 推荐为环保产品推广 应用 (997)。 波灭菌研究进展 微波是波长介于 1000率在数百兆赫至 3000兆赫之间。在美国，在工业、科学研究和医学领域，微波频率的使用是受联邦通信委员会 (理，通常使用的微波频率有915、 2450、 5800和 22125品和药品管理局 (许在商业和家用微波炉中使用 915450 微波在介质中通过时，微波明显地被介质吸收而产生热，该类介质被称为微波的吸收介质，如水就是微波的强吸收介质之一；而当微波能在介质中通过，不易被介质吸收时，该类介质为微波的良导体，在这种介质中产生的热效应很低。微波处理时，物质分子以每秒几十亿次振动、摩擦而产生热能，从而达到高热灭菌的作用；同时微波还具有电磁场效应、量子效应、超电导作用等影响微生物生长与代谢的因素。一般含水的物质对微波有明显的吸收，升温迅速，灭菌效果好。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 波灭菌 机理 微波对微生物的破坏机理 尚存争论。有一种 观点认为 ，和其它由于加热引起的生物物理机制一样，微波引起蛋白质和核酸等生物活性物质的变性和细胞膜的破坏，认为微波对微生物的致死作用完全是热效应。另外 一种观点 认为和非热效应有关。 效应 微波照射热效应的产生，是由分子内部激烈运动所致。极性物质（如水）的分子两端分别带有正负电荷，形成偶极矩，此种分子称为偶极子。当置于电场中时，偶极子即沿外加电场的方向排列，物质内偶极子的高速运动引起分子相互摩擦，从而使温度迅速升高。因此微波加热与其它加热方式不同，不是从外到内传热，微波能达到的地方，吸收介质均能 吸收微波并很快将微波转化为热能，致使微生物死亡。 热效应 （ 1995） 在研究微波对某些肠道内致病菌的致死效应时，第一次提出存在电磁致死效应的可能性。对于微波灭菌的非热效应， 1998） 提出了四种主要理论假设：生物选择性吸收电磁波，所以比周围的液体环境更热而更快就达到灭菌温度。 电磁场的作用下，在细胞膜的较弱部分穿孔，引起细胞内容物的泄漏以及细胞裂解。 过细胞膜的电压足够使细胞膜破裂，从而 导致细胞死亡。电磁场和细胞内重要分子（如蛋白质和 偶联来解释细胞的裂解。细胞内部活性物质在电磁场的作用下被破坏，从而导致微生物死亡。 （ 2005） 以大肠杆菌（ 对象，比较了大肠杆菌和其周围环境（蛋白胨液体培养基）的介电特性（介电常数、功耗因素和损耗角正切），实验结果表明两者的介电特性存在显著差异。其中大肠杆菌有更大的损耗角正切，因此比周围的液体环境产生更多热量，这就可能导致细胞中局部温度升高更快。这就证明了 选择 加热理论。 1988） 在微波处理后的菌悬液中发现了一些细胞内容物的泄漏，如茚三酮反应呈阳性物质、嘌呤和嘧啶。 （ 2000） 研究微波对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌枯草杆菌（ 破坏作用时发现， 2450微波都使这两种菌发生核酸泄漏。而且都随着温度的升高，泄漏越明显；在相同温度下，作用时间越长，泄漏物浓度提高。这就证明了细胞膜破裂理论和内容物泄漏问题。但内容物的泄漏是否是由电穿孔引起，还有待更进一步研究。 （ 1989） 研究了微波对金黄色葡萄球菌（ 亚致死处理条件下对其 整性的影响。结果表明微波处理对 破坏作用显著大于传统的加热处理。虽然两种处理都会破坏 16只有微波处理会对 23成破坏。恢复培养 以后 ，传统加热处理以后恢复正常状态需要 180微波处理，完全恢复需要 270 中， 168023要 270 这就证明了 磁场偶联理论。 此外，国内外学者还做了很多实验发现并 证实了微波灭菌时非热效应的存在。 据 道，在面包上生长的霉菌 孢子 ，经微波照射 2，温度升至 65 ，接种的 孢子 全部死亡。而用一般的加热处理方法，即使在升到 65 之后再加热 2得不到同样的效中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 果。 出曲霉 （ 青霉 (热致死点为 68 71 范围内保持 20 波处理面包 5 高温度达 68 左右，可以在相当长的保存期内不长霉，保存效果极好，但微波处理过程中是从环境温度逐步上升的，不可能将面包在 68 保持 5 10 以，这种灭菌效果可能不只是热作用。 2712频处理接种有酵母的啤酒和酒类，加热到 就见灭菌效果，而普通的巴氏灭菌法须在 60 处理 30有相同作用。 微波照射土壤霉菌与细菌繁殖体时，发现全部被杀灭时的温度较其死亡点低 10 ，因此，认为微波灭菌有非热效应。 吴晖 等（ 1996） 以微波炉 (652)处理接种量为 l106 的 60持菌液温度 60 、 80 和 100 ，对照组为巴氏灭菌法。测定残存细菌数与 处理时间的关系。结果发现，微波灭菌法 巴氏法 照食品热力灭菌理论，腐败菌及其芽胞的耐热性规律可以用 相同菌种、浓度和温度情况下所得 能从它们分别所受处理方法的不同来解释。可见，微波能对微生物的致死过程中确实存在非热效应。这种效应加强了微波对枯草芽胞杆菌的致死效果。 王鲁嘉 （ 1998） 研究比较微波处理和 巴氏灭菌法 对 啤酒酵母 响， 经透射电镜放大后拍摄细胞结构照片 ，试验结果显示 经微波处 理后的细胞各部分结构基本清晰，但在许多细胞中出现小的裂纹。查阅了所有能找到的电镜图谱和照片，均未发现这种现象，所以他假设是微波灭菌所产生的特殊作用的结果。 （ 2005） 在真空条件下，使实验环境保持在 49 64 ，并使水浴加热和微波灭菌温度保持一致，以 对象，测量并比较了三个参数： D 值、 Z 值和活化能（ 与水浴加热相比，微波灭菌的三个参数的测量结果和结论为： 1、低温下 D 值较大，而在高温下，D 值较小，表明环境培养基中存在除了温度的因素外，还有和微波有关的因素，该因素使 在高温下加速了破坏作用。 2、 Z 值较小。水浴加热的 Z 值是 91 ，而在 510W 和 711W 的微波下分别是 62 和 59 ，表明在微波条件下， 温度变化更加敏感。 3、 浴加热的 32kJ/在 5101138和 372 kJ/明微波处理和水浴加热有不同的反应机制。 波灭菌设备 继美国人 P L在 1945年申请了微波加热技术的第一个专利后十年， 1955年，美国泰潘 (司推出了第一 台微波炉。至此之后，微波设备得到了长足的发展。 除利用家用微波炉灭菌外，为了适应工业化生产的需要，研制出了连续灭菌设备。 1974年，1974） 在研究牛肉的微波灭菌时就使用连续灭菌设备。 s 该微波灭菌系统有六个功能：压缩，加热，平衡，保温，冷却，解压缩。由于微波加热时，袋中的水分蒸发出现胀袋现象，再加上加热后温度升高，袋子就很容易破裂。为了避免这种现象的发生，设计了压缩和解压缩功能。即在微波处理前增加环境压力，使微波 处理过程袋子的内外压力大致持平，微波处理后用循环的自来水来冷却降温，防止袋子膨胀破裂。值得一提的是，该装置利用可编程控制器（ 实现中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 4 过程控制。事先经过实验确定灭菌参数，如每个电磁管的功率、空气温度和传输速度。参数确定后利用控制器来实现自动化控制。 随着微波灭菌技术在医药领域的广泛使用，近年还研制出了一些专门用于医疗器材的微波消毒与灭菌设备。例如，丁兰英等 （ 1995） 研制的 牙科器械特别是牙钻消毒提供了具有良好效果 的消毒器械。该消毒器选用 2450200W)微波，体积小(240180350重量轻 (10可 在 治疗台上使用。它利用微波照射与增效剂协同作用，只需照射 可将大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌与白色念珠菌完全杀灭，并将类炭疽杆菌 (胞 杀灭率达到 杨华明等 （ 1995） 研制的 50型微波快速灭菌器，选用 2450650W)微波，可用于手术时所需器械的应急灭菌处理。以其 650 己定协同作用 5可以对放在 聚丙烯塑料密封包内的物品和放在塑料盒内的小型医疗器械达到灭菌。 1996） 介绍了一种用于注射安瓿连续生产的微波连续灭菌器，该微波连续灭菌器可在 3040 ，再经过保温器保温 12s， 达到灭菌效果，之后用空气或水冷却。实验证明这种微波灭菌器具有足够的灭菌效果，而且化学成分降解水平比 高压蒸汽灭菌器低。在连续微波灭菌器灭菌中，采用 25000个安瓿连续灭菌， 可 杀灭 指示生物 ，说明该连续微波灭菌器是一种安全可靠的安瓿灭菌器。 真空技术和 微波技术的结合使热敏性药物 可以实现在低温下进行灭菌， 同时也完善了微波设备。 降低了灭菌的温度，从而大大缩短干燥时间、提高产品质量。其工作温度可在 30 60 之间任意设定，广泛应用于热敏性中药 的加工处理，使得热敏性药物成分及生物活性物质具有极高的保存率 (一般可达 95%以上 )。 此外，杨红旗 等（ 1998） 采用一种特殊的控制电路使微波与紫外线结合起来，制作了微波紫外线联合灭菌仪。 该联合灭菌仪兼具有微波的强穿透性和紫外线的强灭菌能力。 波 灭菌的过程控制 度、微波功率的测定 加热灭菌时，温度、微波功率是微波灭菌时两项重要指标。其中，温度测定是灭菌工程中最重要的管理手段和标准，现有以下几种温度测定技术： 1、红外线放射温度计。该温度计能捕获从物体表面自然放射出的红外线，可以非接触地瞬时测定某点的温度。 2、光纤温度计。光纤温度计是利用在光纤的端面装有反射膜地 半导体形成的小块和光吸收波长与温度具有相关性地原理，将一定弯曲半径的光纤放入光热介质中，温度的变化使过热介质的折射率发生变化从 而导致光纤中光强改变，通过测量光强 得到 所测温度 。它自身不发热，也不接收电磁感应的噪音。 3、热电偶温度计。热电偶温度计 价廉而且耐用 。它的缺点是在微波加热中，它自身会产热，从而引起温度误差， 甚至 会使温度计破损。但也有报告指出，用金属管和铝帽坯顶端保护传感器，可使温度误差保持在 1 左右。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 5 在验证是否存在非热效应时，为使微波辐射与传统加热具有可比性，必须在微波辐射过程中排除物料因微波辐射而不断升温的影响。为此采用了两种方法：一是将体系抽真空 (005)，调节真空度来调节水的沸点，从而使体系处于所需要的温度；第二种方法是利用热交换的方 法 （ 1991） ，在微波装置中安放冷却管，管中通的冷却水带走热量，通过调节阀门来调节水的流速，使微波辐射升温和冷却降温的速率保持平衡。 如果已经知道了样品的质量、热特性和加热时间，我们也可以知道样品达到某个温度时所需要的能量。容腔中的微波功率的测量是用 1991） 的热量测量法。该方法是在大口杯中放上自来水（微波频率为 2450 两个 1升的大口杯中分别放 1升水； 915四个 1升的大口杯中分别放 1升水），盖上盖子防止水分蒸发。加热 2即搅拌然后用热电偶 温度计测量水温。微波功率的测量公式为： P= TM/t 其中： 定压比热（ Jk ）， s）。然而，需要指出的是微波输出会因负载的不同而有所变化。同时，容腔尺寸、壁的构造均会影响微波功率的耦合功率。 果评价 用来判断灭菌效果的指示剂有化学指示剂和生物指示剂。 在设计灭菌过程参数时，必须确定灭菌对象的冷点位置。对于传统的加热灭菌来说，最冷点位于固体物料的几何中心。对于液体物 料来说，其最冷点位于物料从底部开始测量的 1/5处（英国标准）、 1/3处（美国标准） (2002)。只需在最冷点处插入温度探针，就可以实现灭菌的过程控制。但是，微波灭菌和传统的灭菌方式不同。微波灭菌的传热模式比较复杂，样品中冷点的影响因素很多，包括样品的几何形状、样品的大小、微波系统的设计和灭菌对象的介电特性等。由于微波灭菌的不均匀性，对样品进行单点和多点测量是不够的，有必要测量样品中各点的温度。在介电加热研究中，温度测量设备显露出各自的缺点：热电偶温度计会改变所测样品的电磁场，它的金属部分会产生很大的 电流，产生错误的信号，使测量结果误差很大 （ 1988） ；红外线温度计只能测量样品的表面温度 （ 1991） ；光纤温度计虽然不会干扰电磁场，但只能测定有限的几个点的温度（ 1988）。为了解决温度计测量不准确的问题，人们用化学指示剂来解决这个问题。 加热时，样品中的组分发生复杂的化学反应，所以可以根据物质的分解和合成来判断温度的大小和灭菌程度。在高温条件下，有些物质特别是热敏性物质，会被分解而使浓度降低。这些物质包括维生素 氧化物酶、泛酸、维生素 然而，和微生物的破坏程度相比，食品中典型的化学反应的速率常数很小。即使在很高的基线浓度下，反应物浓度的降低幅度很小，测量难度很大。另外，当温度升高时，若要使微 生物得到相同的死亡率，物质的分解速度变慢，使检测工作变得 困难。 另一种方法是利用产物的生成来判断。样品中的醛、酮、还原糖及脂肪氧化生成的羰基化合物能与胺、氨基酸、肽、蛋白质甚至氨发生美拉德反应，最终形成类黑精色素，所以也称为非酶褐变。 1960） 用测定吸光度的方法证明了在 100 条件下发生褐变反应时，吸光度和时中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 6 间呈线性关系。 该技术应用于微波灭菌中不均匀性的测定。他将 葡萄糖和 白质溶液放在袋子的中心，微波处理后进行比色，利用吸光度的不同来确定微波灭菌的不均匀性。 1993） 介绍了三种可用于监测灭菌