【毕业学位论文】（Word原稿）日本血吸虫丝苏氨酸蛋白磷酸酶新基因SjPP的研究预防兽医学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士 学位论文 日本血吸虫丝 /苏氨酸蛋白磷酸酶新基因研究 on a on a I I 摘 要 日本血吸虫病是我国一种危害严重的人畜共患寄生虫病。东方田鼠 是迄今在疫区发现的唯一一种感染血吸虫后不致病的哺乳类动物，免疫机理研究表明东方田鼠血清中的 体，特别是 杀伤日本血吸虫中具有重要作用。 本课题组曾利用东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫成虫 库 ，寻找与东方田鼠抗病相关的血吸虫靶抗原编码基因。本论文从免疫筛库获得的 5 个 列中，选择丝 /苏氨酸蛋白磷酸酶基因进行了深入研究。 丝 /苏氨酸蛋白磷酸酶可逆转蛋白激酶的作用过程，在 蛋白质的可逆磷酸化调节 过程中具有重要作用。 至今，对日本血吸虫丝 /苏氨酸蛋白磷酸酶的研究仍鲜有报道。 1. 根据 列， 利用 5术 首次 克隆获得日本血吸虫 丝 /苏氨酸蛋白磷酸酶新基因 录号 。 该 基因的 906码 302 个氨基酸， 理论分子量 论等电点 生物信息学分析表明 苏氨酸蛋白磷酸酶的特征模块 特异性抑制剂冈田酸的结合位点 家族蛋白 72%）、 71%）、 63%）、 61%）、 59%）具有高度同源性。荧光定量 析显示 因在血吸虫童虫和成虫中都有 表达，表达量由高到低依次为 31d 成虫、 44d 雌虫、 44d 雄虫、 14d 童虫和 7d 童虫。 2. 首 次 构 建 原 核 重 组 表 达 质 粒 ) 核 酸 疫 苗并对其免疫保护功能和免疫保护机制进行研究。 有 )大肠杆菌 导 2h 时，每克菌体产生约 18包涵体形式存在的重组蛋白 析结果表明 有良好的抗原性。 果显示 白能 被东方田鼠血清别是 好地识别 ，可能是东方田鼠体液免疫作用的靶标之一。 学分析结果显示， 纯化并 经 透析复性的 有丝 /苏氨酸蛋白磷酸酶活性， 最适反应 适作用温度为 60 ， 1 4i 2+可 增进 2.3 白免疫 c 小鼠和昆明系小鼠后产生了高滴度的特异性 分别诱导产生了 减虫率 、 和 肝组织减卵率 和 粪便减卵率 （ c 小鼠 ）。酶学分析显示 免疫 组 小鼠体内血吸虫的丝 /苏氨酸蛋白磷酸酶活性几乎完全被抑制 （抑制率 95） 。 显示小鼠血清中特异性抗 体 日本血吸虫体内 白发生作用，可能是诱导宿主产生减虫效果和明显的减卵效果的机制之一。从一个侧面揭示了东方田鼠血清中体抗血吸虫的可能作用机理。 酸疫苗 免疫 c 小鼠诱导产生了 的减虫率， 肝组织减卵率和 便减卵率；免疫昆明鼠诱导产生了 虫率， 肝组织减卵率。 3 成功 构建了 因的 达系统，筛选出 具有干扰作用的 子，为进一步研究 生物学功能奠定了基础。 建重组杆 状病毒 实现在昆虫细胞中的表达。重组病毒染昆虫细胞 染 72h 后融合蛋白 表达量最高。析结果表明 白具有良好的抗原性。 体外培养条件下，成功 筛选出对 日本血吸虫 因 进行 干扰的 312，在 150续作用 8d 时， 因 表达的抑制 效率 为 。目前，正在利用本实验室制备的日本血吸虫基因芯片，探讨 扰 因后日本血吸虫基因表达谱的变化情况。 本论文首次较系统地开展了日本血吸虫丝 /苏氨酸蛋白磷酸酶的研究，对加深理解东方田鼠抗日本血吸虫病机理，寻找抗病相关靶抗原，开拓血吸虫疫苗的研制及新的治疗药物途径具有重要意义。 关键词： 日本血吸虫，东方田鼠，丝 /苏氨酸蛋白磷酸酶， is of a in in a is to in It in . is of M. ST as a in an in of a of as Ps . we on 1. on ST in a a RF 06 02 mo s, to 72%), 59%), 71%), 70%), 63%), 61%). CR of s in 1d 100%), 4d , 44d , 14d ( d ( a 2. o f a a c a ) . of to In 9kD in is a of be in . pH 0 . 1 a 2+ t in we t , OA 1. he . to as c of of in 认为补体参与杀伤童虫的可能性不大。 细胞介素 由活化的 胞分泌的一种细胞因子，具有多种生物学效应。它可诱导 B 细胞分化为 泌细胞，诱导杀伤 T 细胞及 胞的活性 （ B， 1987），诱导单核 类抗原 （ J， 1996），调节造血细胞的增殖及分化 （ M 等，1988） 等。 东方田鼠天然血清中的含量显著高于昆明鼠天然血清，是后者的 。日 本血吸虫尾蚴攻击感染后 9 天，东方田鼠血清中 量达最高， 上升了 K 等，1999） ，这与东方田鼠体内童虫发育停滞开始的时间（约 11 天）接近。 血清球蛋白 邵伟娟等 （ 1996） 和刘宗传等 （ 1999） 所测东方田鼠血液和血清生化指标不尽相同，但 他们都发现东方田鼠血清中白蛋白与球蛋白比例倒置。前者所测球蛋白与白蛋白比值为 者所测比值为 免疫学角度看，球蛋白与机体免疫功能密切相关，此现象是否与东方田鼠抗日本血吸虫机 制有关尚待研究。 乳酸脱氢酶 对于乳酸脱氢酶（ 研究 （ 鲍世民 等， 1994） 发现，东方田鼠血清、红细胞、骨髓和肝中仅含 中 工酶组分均存在，以 力最强。 工酶分子中 A、 B 亚基相对含量与其同功酶活力相对应，除肾内 A 亚基为 B 亚基为 ，其他组织中均仅含 A 亚基。鲍世民 等 认为 工酶特性与东方田鼠抗日本血吸虫病没有直接关系，但骨髓中 A 亚基组成，保证无氧组织在生理生化反应时得到足够能量，使得骨髓生成单核吞噬细胞时有足够的物质基础和能量来源，该 细胞进入肝脏形成巨噬细胞，或可使东方田鼠在免疫反应和抗日本血吸虫病方面具有更强的优越性。 日本血吸虫肠道蛋白酶对东方田鼠血红蛋白的消化作用 血吸虫通过自身的一系列蛋白酶将宿主红细胞中的血红蛋白降解为肽及氨基酸加以吸收利用，这是血吸虫的主要营养来源。王庆林等 （ 2000）分析了 日本血吸虫肠道蛋白酶 对 东方田鼠血红蛋白的作用，发现该蛋白酶能有效降解东方田鼠血红蛋白，且与其对昆明系小鼠血红蛋白的降解无明显差别。故推测日本血吸虫在东方田鼠体内发育受阻可能并非由于血吸虫不能消化东方田鼠血红蛋白而引起营养缺乏所 致。 3. 应用东方田鼠血清免疫筛选抗血吸虫病的可能靶 抗原 基因 东方田鼠具有天然抗日本血吸虫病作用，且体液免疫在抗病中发挥了重要作用。基于此，近几年有多个实验室用东方田鼠血清免疫筛选血吸虫 库，分离与东方田鼠抗血吸虫病可能相关的 靶 抗原基因，从分子水平上加深对东方田鼠抗血吸虫病机制的了解，同时可为抗血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原分子。 阎玉涛等 （ 2001） 用东方田鼠天然血清筛选文库，获得 7 种蛋白质的编码基因：三磷酸甘油中国农业科学院博士学位论文 第一篇 绪论 5 醛脱氢酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、热休克蛋白、 相关抗原、副肌球蛋白、 细胞色素 。张亮 等（ 2003） 以天然血清筛选文库并克隆出新基因 编码产物的 23A 家族有 60%同源性 ， 用 酸疫苗 免疫小鼠，获得较显 著 的减虫率和减卵率。王庆林等 （ 2001） 用东方田鼠感染血清从日本血吸虫成虫 库中筛选鉴定出 3 个新基因，分别命名为 质氨基肽酶。欧阳理等 （ 2002） 分别用东方田鼠的天然及感染血清亲和筛选在丝状噬菌体表面表达的随机十二肽库，用感染东方田鼠血清富集的噬菌体免疫小鼠诱导 了部分保护作用（ 及较高的肝卵减少率（ ，而天然东方田鼠血清富集的噬菌体未见保护效果。 4. 展望 由于东方田鼠具有抗血吸虫病的特异现象，其抗病机制的研究受到了寄生虫学者的高度重视，对其抗病机制在不同方面进行探索，并取得新进展，例如孙军等（ 2004）利用基因谱芯片研究东方田鼠感染血吸虫前后基因表达谱的变化，秦志强等（ 2004）构建东方田鼠骨髓基因池，以期获得东方田鼠抗日本血吸虫病的相关基因。东方田鼠抗血吸虫病机制的研究有 潜在的 应用前景 ，该 鼠有可能发展成为抗日本血吸虫病的动物模型 。 应用分 子生物学、分子免疫学、细胞免疫学等领域的最新研究技术和方法，继续深入探讨东方田鼠抗血吸虫病的分子机制， 筛选并分离出东方田鼠体内存在的抗病相关基因，一方面 为血吸虫病 免疫及 疫苗研究 和治疗药物的开发 提供新思路、新途径 ； 另一方面 ，可 应用转基因技术， 将 东方田鼠抗病相关基因导入血吸虫的保虫宿主，开发抗血吸虫病的转基因动物 。这些 对血吸虫病的防治研究 都 将具有重要的意义。 第三章 寄生虫的丝 /苏氨酸蛋白磷酸酶 可逆磷酸化是真核生物细胞翻译后蛋白质活性调节的一种重要方式，分别由蛋白激酶（使蛋白磷酸化）和蛋白磷酸酶（使磷酸化蛋白 去磷酸化）催化。由于磷酸化的蛋白需要及时地去除磷酸基团以保障细胞生命活动的正常进行，因此，蛋白磷酸酶具有同蛋白激酶同样重要的作用。蛋白磷酸酶根据作用的氨基酸残基不同分为三类：丝 /苏氨酸、酪氨酸和双底物特异的蛋白磷酸酶，近来还发现一种可作用于磷酸化组氨酸残基的蛋白磷酸酶。丝 /苏氨酸蛋白磷酸酶（ 细胞中重要的调节分子， 基本 分为两大家族： 族蛋白可催化磷酸化酶激酶的 亚基，并受热稳定蛋白 特异 性 抑制； 族蛋白可使磷酸化酶激酶的 亚基去磷酸化，不受上述 热稳定 蛋白的 抑制 。根据对抑制剂冈田酸（ 敏感性和是否依赖金属阳离子， 族又可分为三个亚家族： A 非常敏感，纳摩尔浓度的 可抑制其活性。而 要 钙调蛋白（ 要 存在才能完全发挥其活性，两者都不受 抑制。在体外实验中， 使众多底物去磷酸化，逆转蛋白激酶的磷酸化作用，参与细胞代谢、 制、基因转录、 接、信号转导、细胞分化及凋亡、癌基因转化等细胞活动过程 （ 等， 1989； T, 1997） 。随着哺乳动物、模式生物中 克隆和功能研究的突破， 寄生虫中的作用愈来愈引起寄生虫学家的重视。 中国农业科学院博士学位论文 第一篇 绪论 6 1 寄生虫性别特异的 分子水平上研究性成熟和繁殖过程是寄生虫学研究的新 领域 。线虫和果蝇在生殖过程中的相似性表明配子发生的许多方面都是保守的，这一基本的生物学过程也存在于其它的多细胞动物的器官中，因此，寄生虫繁殖过程的研究可参考模式生物在繁殖和配子成熟方面的研究。在脊椎动物和无脊椎动物 中都发现睾丸特异性表达的蛋白激酶和磷酸酶，例如：小鼠的蛋白磷酸酶参与睾丸胚细胞的减数分裂和分化 （ 等， 1999） ；而 调节灵长类动物精子的运动 （ D 等， 1996） 。可见精子的发生过程依赖于激酶和磷酸酶对蛋白活性的调节。已有多个实验室 （ 等， 2001； 等，2000） 的研究结果表明线虫的 因参与精子的发生过程，对该基因进行 扰，精子对卵子的受 精能力降低。 在恶性疟原虫中发现两种仅在有性阶段表达的 因，序列分析表明 1997）是一种与 似的蛋白磷酸酶； L 等， 1998） 则与 构相似，其 N 端存在数个 结构域（ 形成 推进结构（ 可能介导蛋白 A 等， 2002） 。 白具有重要的功能，可与细胞内肌动蛋白相作用，调节基因转录等 （ 等， 2000） 。雄性有 齿食道口线虫（ O. 异性表达的因 （ R 等， 2003） 与线虫的两种 因具有高度的相似性，编码一种丝 /苏氨酸蛋白磷酸酶。对 行基因组分析发现该基因上游存在两个紧密相连的转录因子结合模块 模块也存在于线虫 因和其它雄性特异性表达的基因中，这表明生物中可能普遍存在着 雄性 的表达元件。 线虫基因组中 同源基因（ 在于要进行减数分裂的胚细胞中，但不清楚这两种 与细胞减数分裂的过程有关，还是参 与随后精细胞到精子的成熟过程，或是调节精子的运动和受精过程。线虫的转基因实验表明 不局限在胚系细胞中表达，在神经细胞或神经相关细胞中也有表达 （ R 等， 2003） 。有趣的是， 启动子将报告基因特异性定位在雄性成虫的尾部表达，与 ）或 ）神经细胞相关。一种富含丝 /苏氨酸的蛋白 of 与雄性与雌性 的配对行为，如外阴的定位等。 雌雄虫配对时可能与化学感受器（ 机械感受器（ 号转导有关。而 苏氨酸区域就可能是 酸酶的作用位点。上述研究表明该基因可能参与线虫繁殖的两个独立的过程，即精子发生和雄虫配对的神经信号传递。 2 寄生虫感染与 对于寄生虫生物学的了解有利于 抗 寄生虫 药物的研制 和有效抗虫疫苗的开发。早期的研究表明疟原虫在细胞内的发育受宿主和寄生虫蛋白的磷酸化的调节 （ 等， 1986） ，并且已鉴定出大量的蛋白激酶，包括 激酶（ 等， 1991） 、 酶（ （ M 等， 1996） 和 酶 1（ ） （ 等， 1997） 都参与该过程。与已知蛋白激酶不同，丝 /苏氨酸磷酸酶作为寄生虫中潜在的重要调节因子的作用在最近几年才被发现。利用 行药物抑制性实验表明疟原虫具有 磷酸酶，且疟原虫中中国农业科学院博士学位论文 第一篇 绪论 7 有比 广泛的活性，而宿主红细胞中磷酸 酶活性以 主。同时用 A、 在体外处理疟原虫，发现两种药物对恶性疟原虫在红细胞内生活的三个时期：环状体、滋养体、裂殖体的生长都有抑制，对滋养体的抑制尤甚，且对寄生虫生长的抑制是浓度依赖性的 （ 等， 1998） 。 （ 等， 2002） 克隆出 因，并进行 验，结果发现随着 白翻译的抑制，寄生虫 成受到约 70%的抑制。表明 于调节疟原虫在红细胞中的生长是必需的 。另外，疟原虫 B 等， 1998） ，利用基因组序列分析方法，还鉴定出与催化亚基具有同源性的两个新序列 （ 等， 1999） 。 小泰勒虫中也检测出丝 /苏氨酸蛋白磷酸酶的活性，利用 异的抑制剂或激活剂研究发现，寄生虫体内蛋白磷酸酶活性以 主，而 牛的白细胞中发挥主要的磷酸酶活性 （ 等， 2000） 。从感染细胞中纯化出来的小泰勒虫不仅自身表达 ）蛋白的活性， 已有报道认为 径中 活性 （ K 等， 1997） 。因此可推断，泰勒虫的 性的增强与寄生虫感染的宿主细胞中 去磷酸化相联系 （ 等， 1998） 。但泰勒虫 其自身的 白的关系尚需进一步研究。这些研究结果表明寄生虫的 能与寄生虫对宿主的感染和在宿主体内的生存有关。 3 寄生虫排泄作用与 称作钙 调神经磷酸酶（ 在血吸虫的焰细胞（ 大量表达 （ 等， 2000； 等， 2003） ，可能对于寄生虫的存活很重要。血吸虫的焰细胞具有纤毛，分布在虫体的实质中，与体内密布的排泄管道相通并与排泄孔相连。这些细胞通过超滤作用收集实质中的代谢废物和液体，并将其排出体外。 两个亚基组成，即分子量为 60催化亚基（ 19调节亚基（ 钙调蛋白和 在时，其磷酸酶活性增强。 有高亲和力，它与 结合对于发挥完全的磷酸酶活性是非常必要的 （ 等， 1995） 。免疫荧光定位发现 等， 2000） ，这与 脊椎动物肾脏组织中的表达情况相似。 肾脏的近端小管和收集管都有大量表达，但 前者中的活性是后者的 10 倍（ A 等， 1997） 。在不同膜受体介导的信号传导途径中，作为胞内 度增加的结果，使肾脏组织的 K+磷酸化而活化。在酿酒酵母中表达的曼氏血吸虫活性受到酵母 的调节 （ 等， 1998） ，表明 与血吸虫体内离子平衡的调节，其生理功能的研究可能开发出新的抗虫药物。 4 抗虫药物与 疫抑制药物环孢素 A（ ， 有杀 伤寄生虫 功能，尤其是对血吸虫、疟原虫、绦虫和血丝虫 （ 等， 1996） 。研究发现 与一种免疫亲和蛋白 合形成复合物，从而抑制 活性。 酸酶活性的抑制导致转录因子 续磷酸化，致使 能从细胞质转移到细胞核内，这 样，依赖 基因，如 不能表中国农业科学院博士学位论文 第一篇 绪论 8 达，从而造成 T 细胞和 B 细胞免疫功能的降低 （ 等， 1996） 。推测 寄生虫中也通过相似的机制发挥抗虫作用。 已从疟原虫克隆出 3 种 用 变体进行实验表明， 合形成的复合物可抑制 活性。但以小分子对硝基苯磷酸（ 底物时， 活性不受 抑制 （ 等， 1999） 。这可能是因为 合物部分占据了蛋白磷酸酶与底物结合的位点，但不能阻止 合所致。奇怪的是，从小口膜壳绦虫纯化出的 钙调蛋白依赖的磷酸酶可被哺乳动物 合物抑制，但不受自身的制 （ C 等， 1997） 。在曼氏血吸虫的研究中，发现 与 合，抑制 磷酸酶活性，但其衍生物 管具有更强的杀虫效果，然而对 没有抑制作用 （ 等， 1999） 。看来 性的抑制与虫体的死亡没有必然的联系，推测 是 虫作用的关键靶位点。 5 寄生虫中发现的其它 原虫 首次在顶复合器门寄生虫中发现含 蛋白（ 等， 2001a） ， 蛋白 是长链脂肪酸激活磷酸酶活性所必需的 （ J 等， 2002） 。 恶性疟原虫的各生活阶段都可表达，对 度敏感，可与热激蛋白 90 共作用。其 疫荧光实验也发现 要在细胞核中表达 （ 等， 2002） 。抑制 胞中 表达，发现糖皮质激素受体（ 集在细胞核内，不能再进行核质穿梭 （ A 等， 2001） 。因此，可以推测 寄生虫基因转录的调节中具有重要作用。其作用模式可能是 合物结合，使 磷酸化并与转录复合体脱离，从而调节基因的转录。 （ 2001b） 在恶性疟原虫中发现一种新的 特异性抑制剂 不敏感，其 蛋白的含量在各个时期是不同的：裂殖体中 含量最高，环状体中次之，滋养体中最低。 （ 2004） 则首次发现一种双底物特异的具有锌指结构的寄生虫蛋白磷酸酶 疟原虫的红细胞内期表达，并可进行核质穿梭。 与核内蛋白 互作用，调节寄生虫的发育。另外， （ 1993） 和国内成军等 （ 2001）克隆了 利氏曼原虫的 因，为抗虫基因疫苗的研究奠定了基础。 6 展望 同蛋白激酶相比，已发现的蛋白磷酸酶的种类较少。 调节亚基或与 合的蛋白决定着 亚细胞定位和底物的专一性，发挥特异的生物学功能。例如哺 乳动物的 以三聚体形式存在，催化亚基和结构亚基各有两种，调节亚基则存在着 B、 B、 B、 B 等不同家族的蛋白，三种亚基不同的组合方式可形成 75 种 卫军等， 2003） 。另外，新的 断被发现和克隆出来，丰富了蛋白磷酸酶家族的成员。 对 寄生虫 研究开展较晚，并且 寄生虫与宿主的关系密切，具有不同于模式生物的独立的生物学过程，这为寄生虫 研究带来极大的挑战。 如能 建立 寄生虫 成熟的体外培养环境，将基因功能分析的新技术，如 基因技术等应用于寄生虫 究过程，了解 寄生虫基础 代谢、生殖和感染宿主等过程中的作用，中国农业科学院博士学位论文 第一篇 绪论 9 在分子水平上阐明其在寄生虫生长、发育和繁殖过程中的生物学功能，将为寄生虫病的防治提供新的药物作用位点和开发有效的抗虫疫苗。 第 四 章 扰技术及其在寄生虫研究中的应用 扰（ 双链 导的 、 序列特异的靶基因转录后基因沉默的过程。 然存在于各种生物体中，如果蝇、线虫、原生动物、脊椎动物、高等植物等，在保持基因组的纯洁、抵抗病毒的入侵、控制生物发育、染色体的异染色质化等方面都具有非常重要的作用。 自 1998 年 （ 1998） 首次将 象定义为转录后基因沉默（ ， 应用 术进行基因功能的研究迅速在各种生物中开展起来。 1 用机理 目前，对细胞内 详细发生机制的了解并不十分清楚。模式生物秀丽新小杆线虫（ 果蝇（ 研究结果认为：生物体天然存在微小 基因，在细胞核内转录生成含有几百个或几千个核苷酸的原始 ，由 家族的 等， 2003） 切割生成 703端有 2 个核苷酸的尾巴，呈发夹状结构。 入细胞质，由 家族的 割形成成熟的约 22 导的沉默复合物 （ 结合，并在该复合物解旋酶的作用下解旋，只留下反义链以识别和结合目的基因的 反义链与靶基因的 列完全或近似完全配对时，通过 降解 而在转录后水平抑制靶基因的表达；当 可能与靶基因 端 结合，在翻译水平抑制基因的表达。另外，还发现细胞内 可通过某种机制造成组蛋白的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。 大多数 验都是指外源的 细胞内 别并切割成小分子干扰 ,介导体内转录后基因的 沉默过程。 不同的生物体内具有不同的特征，如在植物和线虫中 系统发生并可遗传给后代，在哺乳动物和果蝇中则不存在此现象。 生物体内的传递需要 子的扩增，研究发现细胞内 赖的 合酶 （ NA 可以 子的反义链为引物，靶基因的 新合成的 被 切割产生新的 子，从而放大 生物的系统发生中具有保守性，在寄生虫体内也发 现存在 作用体系：对溶组织内阿米巴 虫 （ 因组数据库进行搜索，发现存在 源蛋白的基因序列 （ 等， 2004） ；布氏锥虫 （ 的无细胞提取物可在体外模拟 作用过程，表明锥虫体内具有与 用类似的蛋白 （ 等， 2005） ，并且从布氏锥虫体内鉴定出与 白类似的该 蛋白是锥虫发生 程所必需的 （ 等， 2003） ；对伯氏疟原虫（ 基因进行干扰后，发现 提取物中存在约 25 国农业科学院博士学位论文 第一篇 绪论 10 A 等， 2003） ，证实外源的 在细胞内产生转录后基因沉默过程，在 用下合成新生链，并被 割产生新的 述发现为 术应用于寄生虫学研究提供了理论基础。 2 术 2.1 应分子的设计 应分子的设计一般满足下列原则： 1）从靶基因起始密码子下游 50开始选取具有 19)21)或 17)N ：任何核苷酸； R：嘌呤； Y：嘧啶）特征的序列，避开基因的内含子区及 5和 3非翻译区； 2） 量不大于 50%； 3）进行索，排除那些和其他编码 基因 /源的序列。根据上述原则，有许多研究机构或公司开发了大量的免费或商业软件来辅助设计 应分子序列，如 et 、 、 等。另外，设计 到基因组的序列差异的影响，基因组的序列差异是生物系统的一个重要特征，这一差异可在 平反应出来。单核苷酸多态性 （ 人类基因组中每 300 500 个核苷酸就出现一次 （ R 等， 2004） 。基因的多态性可能影响 应分子序列的设计。另外， 可变性剪切、组织或时期的特异性表达等也会影响 效果。 应分子合成方法的比较 目前实验用 应分子有两种形式，即小的干涉 短发夹结构 其不同制备方法的比较见表 1。 应分子的介导方法 对体外、体内寄生虫进行 应分子的介导常用的方法有浸泡、饲喂、电穿孔、微注射、静脉注射等。 涉效果的评价标准 平分析 有许多方法可用于分析 靶基因 干涉效率，包括 交、 定量 。目前常用的在 平分析 方法是基于 定量 方法。任何定量 须对实验条件进行优化，特别是当模板量较低时。与蛋白分析不同， 般是在转染 36h 或 72h 后进行。 蛋白质水平的分析 通常用靶基因编码蛋白的 特异性 抗体分析 达水平 的 变化 ，如 疫组化方法或对靶基因编码蛋白进行酶学活性检测。靶蛋白的半衰期对于选择分析蛋白水平改变的时间非常重要，因为当新的蛋白合成受到抑制时，才会观测到蛋白浓度的降低。而且，为了观察半衰期 较长的蛋白浓度的降低，使用具有长时间干涉效应的 具有优势。 代分析 寄生虫 个体或细胞 进行 验后，为进一步验证靶基因的功能，还可以进行替代分析，即将靶基因编码蛋白注入已进行干涉的虫体细胞中，观测该蛋白能否使靶基因表达沉默的细胞恢中国农业科学院博士学位论文 第一篇 绪论 11 复正常，从而将针对靶基因的 成的理化改变与抑制剂或非特异性干涉造成