【毕业学位论文】（Word原稿）黄瓜重要抗病基因的分子标记研究及遗传图谱的构建蔬菜学博士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 黄瓜重要抗病基因的分子 标记研究及遗传图谱的构建 ap of 要 黄瓜是全球普遍栽培的主要蔬菜作物，其栽培面积在我国保护地蔬菜中居首位，对保 证我国蔬菜周年均衡供应方面具有十分重要的作用。目前黄瓜的分子生物学研究基础比较薄弱，这一方面给黄瓜分子遗传的研究造成困难，另一方面也为我国在分子生物学的研究进入世界研究前沿带来了机遇。因此，开展黄瓜的分子育种研究具有重要的理论和应用意义。 建立分子标记辅助育种技术系统并构建饱和通用的黄瓜遗传图谱是开展黄瓜分子育种研究的基础。黄瓜的重要经济性状较多，其中抗病性尤为重要，但抗病性的鉴定在技术上较为复杂，易受环境、菌种质量、操作水平等影响，特别是多种病害的同时鉴定，更有许多技术上的问题有待解决。因此，建立黄瓜抗病 性分子标记辅助育种技术系统是首选研究课题。黄瓜分子遗传图谱构建的研究已经取得了重要进展，但是已构建的图谱多数是以 作图群体的临时图谱，并且图谱的饱和度均不高，采用的作图群体和分子标记各异，缺乏通用性和实用性。因此，采用永久作图群体构建饱和通用的黄瓜遗传图谱是当前需要解决的问题。 本项研究从当前黄瓜分子生物学研究的现状、育种的需求以及我们已有的工作基础出发，确定以建立黄瓜抗病性分子标记辅助育种系统为切入点，首先开展五种主要病害抗性基因连锁分子标记研究；与此同时，以 体为材料构建黄瓜分子遗传图谱，逐步 对重要性状进行基因定位，并且开始筛选用于图谱整合的 定标记，为最终通过图谱整合策略，构建高密度、通用性和实用性强的黄瓜栽培种分子遗传图谱打好基础。 本项研究取得如下主要结果： 1. 利用黄瓜重组自交系群体和 2 个 离群体，对五种主要病害的抗性遗传规律进行了研究。结果表明：黄瓜抗病材料“秋棚”对小西葫芦黄化花叶病毒（ 番木瓜环斑病毒西瓜株系（ 西瓜花叶病毒（ 种病毒的抗性分别由一对隐性基因控制，但也存在微效基因的修饰作用，同时，三种病毒病的抗性基因存在紧密连锁关系；抗病 材料“ 枯萎病生理小种 4 的抗性由一对显性基因控制，对白粉病的抗性符合一对隐性主基因 s，一对显性加强基因 R 和一对抑制基因 I 控制的遗传模式。 2. 利用上述材料，对五种主要病害的分子标记进行了较系统的研究，并建立了抗病毒病的分子标记辅助育种系统。 1) 获得与 性基因连锁的 记 记 及 记 12 连锁距离 分别为 510101014 6 2) 获得与 性基因连锁的共显性 记 记与 病基因连锁的 记 连锁距离 分别为 2 9 3) 获得与 病基因连锁的 记 连锁距离 为 3 4) 获得与枯萎病抗性基因连锁的 记 记 和 记 连锁距离 分别为 77 14 5) 获得与白 粉病抗性基因连锁的共显性 记 连锁距离 分别为 5 13得与白粉病感病基因连锁的 记 记 连锁距离 均为 7 6) 应用上述连锁标记，初步建立了抗病毒病的分子标记辅助育种系统。利用单个分子标记进行辅助选择，三种病毒病分子标记检测结果与表型鉴定的符合率为 82%利用两侧标记进行辅助选择，符合率达到 95% 3. 利用（秋棚欧洲八号）的黄瓜重组自交系为作图群体，构建了我国第一张黄瓜分子遗传图 谱。图谱由 9 个连锁组群组成，包含 238 个标记，总长为 记平均间隔 是目前国内密度最大的黄瓜栽培种永久分子遗传图谱。由于作图群体为世界上应用最广的欧洲温室生态型和华北露地型黄瓜的杂交后代，该图谱具有较好的代表性，可以作为基本图谱与其他图谱进行整合，构建高密度、代表性和通用性更好的黄瓜分子遗传图谱。 4. 黄瓜对 种病毒的抗性基因被定位在上述遗传图谱的第二连锁群上，并且簇聚在 15区间。其中， 种抗性基因在遗传图谱上的同时定位是国内外首次报道。 5. 利用上述黄瓜 重组自交系群体和 2个 适于图谱整合的锚定 记进行了筛选，获得了在 亲本间有多态性的 物近 20 个和能够直接用于图谱整合的 记 3 个，但还不足以用来进行图谱整合，今后需要继续寻找更多的锚定分子标记。 关键词 黄瓜，抗病性，分子标记，遗传图谱 is it is in a in is us to on on of in is of in of is by so in of a of 2 is of on we to up a at to a on SR to to in My to 1. 2 I on to as a to as a to by a s, a a . 2. I to a 1) to 1010101cM 2) MV to MV 2cM 3) to 4) to 7cM 4 5) SR to cM 3 63to 6) of C1 of 2% AS of 5%3. IL of a o. 8 a 38 139 4 3 89 in a 27.5 an in it be as to to 4. 5 cM of MV 5. IL 2 of to SR 0 be in a 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 增片段长度多态性 卞青霉素 菌人工染色体 bp 基对 合分组分析法 解扩增多态性序列 补 cM 摩 六烷基 溴化铵 二胺四乙酸 达序列标签 丙基硫代 of 然比 记辅助选择 苷酸结合位点 等基因系 体亲本 放阅读框 合酶链式反应 量性状基因座位 R 抗病 机扩增多态性 病基因类似物 组自交系 S 病 异性序列扩增 链核苷酸多态性 单序列重复 列标签位点 目 录 第一章 引言 . 1 瓜主要病害抗性遗 传规律研究进展 . 3 瓜枯萎病抗性遗传规律研究进展 . 3 瓜白粉病抗性遗传规律研究进展 . 4 瓜病毒病抗性遗传规律研究进展 . 7 子标记技术与分子标记辅助选择研究进展 . 8 用分子标记的种类、原理 . 8 子标记辅助选择育种研究进展 . 11 因组图谱与比较图谱研究进展 . 14 因组图谱的种类 . 14 因组图谱作图的原理和基本方法 . 15 建基因组图谱时存在的问题与解决途径 . 16 较图谱研究 . 17 瓜分子育种研究进展 . 18 质资源亲缘关系和遗传多样性的研究 . 18 标性状的连锁分子标记与分子标记辅助选择 . 19 种纯度的鉴定 . 19 子标记遗传图谱的建立及基因定位 . 20 项研究的目的和意义 . 24 第二章 黄瓜五种主要抗病基因的连锁分子标记研究 . 26 料与方法 . 27 料 . 27 法 . 27 果与分析 . 35 瓜三种病毒病抗性基因簇聚性与相关分子标记研究 . 35 黄瓜枯萎病生理小种 4抗性基因紧密连锁的分子标记研究 . 52 黄瓜白粉病主效基因紧密连锁的分子标记研究 . 55 论 . 63 要病害抗性基因遗传规律的探讨 . 63 于 . 64 子标记辅助选择影响因素探讨 . 66 第三章 黄瓜分子遗传图谱构建与重要抗病基因定位研究 . 68 料和方法 . 68 料 . 68 法 . 69 果与分析 . 74 瓜分子遗传图谱的构建 . 74 瓜主要 病毒病抗性基因的基因定位 . 80 瓜图谱整合的锚定标记的筛选 . 81 论 . 85 研究构建的遗传 图谱与其他黄瓜遗传图谱的比较 . 85 2群体在构建遗传连锁图谱中的优劣性比较 . 85 . 86 用 . 86 瓜遗传图谱构建难点探讨 . 86 全文结论 . 88 参考文献 . 90 致 谢 . 99 作者简历 . 100 图表目录 表 经发表的黄瓜遗传图谱 . 25 表 瓜 . 37 表 黄瓜 . 41 表 黄瓜 . 42 表 子标记检测与田间抗感表型的符合率 . 50 表 时使用 R%） . 51 表 子标记检测与田间抗感表型的符合率 . 51 表 检测与田间抗感表型的符合率 . 52 表 9032 的 . 56 表 黄瓜白粉病主效基因连锁的 . 61 表 于图谱分析的 . 75 表 于图谱分析的 . 76 表 于图谱分析的 物对碱基序列 . 76 表 建图谱的标记 . 77 表 种分子标记在分子遗传图谱上的分布 . 79 表 洲八号和秋棚两个亲本之间具有多态性的 . 82 表 . 83 表 9032两个亲本之间具有多态性的 . 84 图 试黄瓜 亲本接种 . 35 图 . 36 图 体中的柱型分布 . 37 图 瓜 . 38 图 物 . 39 图 物 增结果 . 39 图 物 1的 . 41 图 物 增结果 . 41 图 物 . 42 图 物 . 43 图 物 . 43 图 物 . 44 图 物 . 45 图 物 . 45 图 洲八号和秋棚两个亲本差异片段序列比对 . 46 图 物 . 47 图 物 . 47 图 物 试黄瓜双亲、 . 48 图 三种病毒病抗性基因连锁的分子标记遗传连锁图 . 49 图 萎病标记研究中供试亲本及 . 52 图 萎病标记研究中 感池的扩增谱带 . 53 图 萎病标记研究中 感池的扩增谱带 . 53 图 物 2单株中的 扩增结果 . 54 图 物 2群体中的 果 . 54 图 物 2单株的扩增结果 . 55 图 粉病标记研究中供试亲本及 . 57 图 粉病标记研究中 . 58 图 粉病标记研究中 感池的扩增谱带 . 58 图 物 供试亲本及 . 59 图 物 供试亲本及 . 60 图 粉病标记研究中 . 60 图 物 2单株的扩增结果 . 61 图 物 . 62 图 物 供试双亲及 . 62 图 黄瓜白粉病抗性相关基因连锁的分子标记遗传距离 . 63 图 . 77 图 . 78 图 . 78 图 棚 欧洲八号的重组自交 系遗传图谱 . 80 中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 黄瓜（ .）在世界上广泛栽培，中国是世界上黄瓜栽培面积最大、总产量最高的国家，据农业部数据统计， 2005 年我国黄瓜总播种面积为 公顷，其中保护地栽培面积达 62 万公顷。近年来，我国黄瓜遗传育种取得很大成绩，通过常规育种已经育成许多优良品种在生产上推广应用。当前，特别需要开展黄瓜的分子育种技术研究，使之与常规育种相结合，培育高产、优质兼抗多种病害的黄瓜新种质与品种。与美国等发达国家相 比，我国在葫芦科瓜类作物基因组学研究水平上虽然存在一定差距，但与茄科作物、十字花科芸薹属蔬菜作物相比，从研究的起点与时间上来看仍处于同一起跑线，我国还有力争赶上的可能。根据“有所为、有所不为”的原则，只要发挥自己的优势，在学习与引进国外的研究成果的基础上，我国完全有可能也有必要在葫芦科瓜类作物的基因组学研究开展一些具有原创新性的研究，为我国瓜类蔬菜产业的健康发展提供强有力的技术与资源保证。 分子标记技术的飞速发展，使黄瓜育种中的间接选择成为可能，大大提高了遗传分析的准确性和选育的有效性，因而分子育种技术在黄 瓜的遗传育种领域越来越受到重视。遗传图谱构建和分子标记辅助选择（ 分子育种技术研究的两个重要研究内容。一张高密度的遗传图谱是进行遗传育种工作的前提，也为基因定位、克隆及基因组结构和功能的研究打下基础。饱和的遗传图谱可以为育种工作者提供该物种详细的基本资料，而重要性状的基因定位，将使育种的目的性更强、效果更好。传统的形态和生化方法获得的标记数目少，很难使遗传图谱精密，很难反映基因组的全部情况。目前蔬菜作物中已经构建了番茄、甘蓝、马铃薯、辣椒、莴苣、胡 萝卜、芥菜、豌豆、黄瓜、白菜、芹菜等大约 20 种蔬菜遗传图谱，其中番茄、马铃薯、甘蓝等作物的图谱已经趋于饱和，包含上千个分子标记。早在 1992 年， 就首次发表了番茄的高密度连锁图谱，此图以 记为主并包括同工酶和形态学等遗传标记共1030 个，平均每 有 1 个标记，并与经典图、细胞学图作了对比，使番茄的遗传图谱达到一个新的水平，成为当时高等植物中标记最多的遗传图谱。迄今，番茄的遗传图谱已经发展到 1668个分子标记，并由 多种分子标记组成。分 子标记辅助选择技术准确、快速、且不受基因型影响，因而在多基因聚合上具有独特优势，成为目前研究的热点（刘志文等， 2005）。目前在水稻、棉花、小麦等大田作物均有利用 术实现抗病性改良的报道。特别是水稻利用 术，已取得较大的育种成效，育成一批水稻新品系 (黎志康， 2005；万建民， 2006)。然而，与水稻等大田作物相比，黄瓜乃至整个蔬菜作物分子生物学研究基础比较薄弱，已经定位的蔬菜重要农艺性状的主效基因不是很多，可用于 基因更是有限，已经构建的图谱常常采用不同的标记技术和亲本材料，致使在应用标记 信息进行品种改良时常常出现混淆或受挫。同时可用于 于操作的 记不是很多， 析技术要求较多，成本相对较高。技术上的相对滞后，已经成为瓜类蔬菜作物聚合多基因难的一个重要原因。因此，构建饱和通用的遗传图谱并进行重要性状的基因定位获得简单实用的紧密连锁分子标记将是今后黄瓜分子育种工作的重点。 与水稻等大田作物相比，黄瓜分子标记辅助育种研究存在不少差距，但目前随着生物信息学数据的爆炸式增长以及日新月异的分子标记技术支持，黄瓜的基因组学研究仍取得了很大进展。中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 2 分子标记技术已开始广泛应用于黄瓜遗传图谱的构 建、重要性状的基因定位、分子标记辅助选择、种质资源遗传多样性分析和亲缘关系鉴定、种子纯度与活力鉴定等黄瓜遗传育种的诸多方面，同时还启动了一些重要基因的克隆和分离研究 (顾兴芳等， 2005)。 自上世纪 80 年代开始，世界各国学者陆续利用各种表型标记（形状、抗病、抗逆等标记）、生化标记（同工酶标记）、分子标记（ ），构建了近 20张黄瓜遗传图谱。已有的研究表明，黄瓜是遗传变异相对狭窄的异交作物（ et 1994；et 1990）， 栽培品种的遗传多样性相对较低（ et 1997； et 1996；et 1987），已构建的黄瓜遗传图谱的饱和度也较低（ et 1992； et 996； et 1997； et 2000）。采用多种类型的分子标记，增加标记的数量以及对基于不同分离群体构建的图谱进行整合集成是较大幅度提高黄瓜分子图谱饱和度的重要途径。对已有分子图谱的整合将有利于与重要经济性状紧密连锁的分子标 记鉴定，从而促进标记在分子标记辅助选择方面的应用（ et 1995）。美国 学的 验室在黄瓜分子图谱的构建和整合工作中做出了卓有成效的工作（ et 2000），他将以黄瓜栽培种和栽培种杂交为群体的所获得的 5 个连锁图谱（ 1987; 1992; et 1994; 1996; 1997）整合成一个具有 134 个位点的连锁图谱，图谱长度 431个标记间平均间隔 时，他还将以黄瓜栽培种和野生种杂交为群体的所获得的 5 个连锁图谱整合成一个具有 147 个位点的连锁图谱，图谱长度 458个标记间平均间隔 以往工作基础上， 001)对上述群体进行了 析，并以他们作为锚定标记进行图谱整合工作。以黄瓜栽培种和栽培种杂交为群体，10 个连锁群，包含 态学等 255 个标记，平均标记间隔为 虽然整合后的图谱密度大大