【毕业学位论文】（Word原稿）马传染性贫血病驴白细胞弱毒感染性分子克隆及其衍生毒的生物学和分子生物学特性分析预防兽医学博士论文4

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 马传染性贫血病驴白细胞弱毒感染性 分子克隆及其衍生毒的生物学和 分子生物学特性分析 In n of 国农业科学院博士论文 摘要 I 摘 要 为了阐明马传贫驴白细胞弱毒疫苗（ 弱及免疫保护的分子机制，给其它慢病毒的免疫预防提供借鉴，本实验室构建了 染性分子克隆（命名为 获得其衍生病毒（命名为 同 时对我国马传染性贫血病毒强弱毒株进行了序列分析。在此基础上，以 骨架，构建了马传染性贫血病毒强 /弱 合毒感染性分子克隆（命名为 并获得了其衍生病毒（命名为 本研究对 过对临床和病理组织学变化、各结构蛋白抗体、感染马体内病毒载量的监测以及 因在感染马体内的变异规律进行了研究。 将 7 匹 性健康马分为 4 组，第 1 组（ 4#和 5#马）接 50合毒（ 第 2 组（ 6#和 7#马）接种 505隆毒（ 第 3 组（ 8#）接种 505同时设第 4 组（ 1#和 2#马）作为非接种对照组。接种后第 220 天，除了2#马攻毒剂量为 30清稀释度外 ， 其它 所有马均用 30清稀释度 毒辽宁株（ 行攻击。 攻毒前后对每匹马进行体温监测，发现在接种后，所有试验马未见体温升高现象，说明我们所用的毒株接种后对马是很安全的，用 换 到的嵌合病毒对马也没有表现出临床致病性； 攻毒后， 非接种对照组 1#和 2#马体温均出现典型的稽留热，并分别于攻毒后第 134 天和 19 天死亡， 病理剖检发现死亡马呈现典型的马传贫的病理组织学变化。第 1 组和第 3 组（嵌合毒接种组和疫苗毒接种组）在攻毒后未见任何临床变化，证明嵌合毒和疫苗毒接种马得到了免疫保护。第 2 组（克隆毒接种组）中的 6#马在攻毒后没有异常变化，而 7#马却经历 6 次发热期，最终于攻毒后第 185 天死亡，但开始发热和死亡的时间均比对照组明显滞后，病理剖检发现发病死亡马具有典型的马传贫的病理组织学变化。 在攻毒后第 450天剖杀所有存活马，并进行病理组织学检查，结果表明所有免疫保护马均未见任何异常变化。 在试验过程中，我们利用 法对不同试验马攻毒前后血清中针对 构蛋白 及 抗体进行了检测。 攻毒前各接种马抗 体水平极低或检测不到， 体上升后又逐渐下降， 体缓慢上升后并持续在较高水平。攻毒后发病马（ 1， 2， 7）体内抗 体均显著升高，并持续至死亡， 6和 8马体内抗 体也有升高外。攻毒后，嵌合病毒免疫马（ 4和 5）体内抗这五种结构蛋白抗体和攻毒前没有明显变化，表明攻毒后没有回忆反应，表明其 免疫效果可能优于其它各接种组 。 抗 体变化在发病马和未发病马间无明显差异，提示 体变化与疾病进程没有直接的关系。 利用实时定量 术对攻毒前后马外周血白细胞中 病毒 马血浆中病毒载量进行了监测，发现感染马体内前病毒 量与 体水平有一定的相关性，血浆中病毒 载量与 体水平成正相关。发病马血浆病毒 过 106 拷贝 /浆，而免疫保护马血浆中病毒 量较低（ 100贝 /浆）。免疫保护马在攻毒后3 个月血浆病毒 到很低水平，用实时定量 法检测不到。但在整个试验过程中，在中国农业科学院博士论文 摘要 试验马外周血白细胞中均能检测到 病毒 明马传染性贫血病毒以前病毒形式长期潜伏存在。 由于 因组具有高度变异性，特别是 因 的变异可能与病毒的致病性及免疫保护性有着密切的关系。因此，本实验对攻毒前后马外周血白细胞中 病毒的 括 R 区）和 括 3,4,5 在内的 580 个核苷酸）基因进行了序列测定和分析，发现 马体内存在 3 种序列类型，即强毒型（序列与 致）、弱毒型（序列与 致）和中间型（ 混合序列）。 对 毒感染性分子克隆及其衍生毒免疫后攻毒马长时间跟踪，并采血样进行 因序列分析，结果发现马体内同时存在强毒型和弱毒型的序列以及少量的强弱毒衍化的中间型序列。当强毒型 因序列占绝对优势时，马表现临床发病。 对 基序分析表明，强毒型 增强子高变区没有 序，而在 合处有 1 个 序 ，而弱毒 增强子高变区有2 个 序， 在 合处 没有该 基序 。推测该基序的变化对病毒的致病性可能有一定的关系。对 列分析发现， 在攻毒后获得免疫保护的马体内存在着大量的带有强毒特征，但在其中发生移码突变和 /或出现终止密码的 因序列，这些缺陷型前病毒的大量存在可能 与免疫保护存在一定的关系。在我们所测的 175 个氨基酸中，强毒型 列比弱毒型 列多 4 个糖基化位点，而中间型位于二者之间，由于糖基化位点可以屏 蔽抗原位点，使病毒逃避免疫系统的监视，因此糖基化的数目和位置对病毒致病性有着一定的影响。 关键词：马传染性贫血病病毒，感染性分子克隆，嵌合病毒，实时定量 国农业科学院博士论文 摘要 n n to of of as on a by as In 4# #) 6# #) 1# #) of no of TR of TR t in (2#) (1#)of 9 34 no , # no # of 85 1#, 2# #) IA at 4#, 5#, 6# #) 50 no p9 on by p9 or to at of in ， 2 to in . in # # or no no so to no NA NA in of 国农业科学院博士论文 摘要 IV by CR We NA of NA to 06ml in in to NA be as TR By ed TR we TR In TR be in TR of in is 3 So it is be By of we in of or of an in of By 175aa in of of in 中国农业科学院博士论文 目录 1 目 录 摘 要 . I . 言 . 1 文献综述 . 2 一、 分子生物学研究进展 . 4 1 囊膜糖蛋白 变异与机体体液免疫的成熟 . 4 因是高度变异的 . 4 白的糖基化 . 5 体体液免疫的成熟 . 6 2 基质蛋白 位与 机体的细胞免疫 . 7 因及其编码的蛋白 . 7 质蛋白 位 . 8 激机体所产生的细胞免疫 . 8 3 编码区 高度变异性与细胞因子的关系 . 8 变异性 . 8 细胞因子的相互作用 . 9 相互作用 . 10 二、慢病毒疫苗研究进展与展望 . 11 三、小结 . 12 研究报告 . 13 实验一 隆毒和嵌合病毒免疫马攻毒前后体内各结构蛋白抗体水平及病理组织学的研究 . 13 1 材料 . 13 株 . 13 验动物 . 14 剂 . 14 器 . 14 2 方法 . 15 验分组及病料采集 . 15 清抗体的检测 . 15 试验马解剖学变化 . 15 试验马各脏器病理组织学检测 . 16 铁试验 . 16 3 结果 . 16 种及攻毒后各匹马的临床反应 . 16 毒前后各结构蛋白抗体的变异 . 18 实验二 利 用 外周血白细胞 病毒及血浆中病毒 量的测定 . 31 1 材料 . 31 株 . 31 验动物 . 32 粒 . 32 剂 . 32 中国农业科学院博士论文 目录 1 胞培养用试剂 . 32 器设备 . 32 2 方法 . 33 验分组及病料的采集 . 33 外周血白细胞的制备 . 33 血浆的处理 . 33 病毒 提取 . 33 毒 提取 . 33 物的设计 . 34 准曲线的建立 . 34 准曲线的建立 . 34 3 结果 . 36 准曲线的建立 . 36 准曲线的建立 . 36 毒 测结果 . 37 毒 测结果 . 39 实验三 合病 毒接种马攻毒前后马外周血白细胞中 . 42 病毒 列的测定及分析 . 42 1 材料 . 42 株 . 42 验动物 . 43 剂 . 43 器 . 43 2 方法 . 43 验分组及病料的采集 . 43 种和攻毒后各试验马不同时期外周血白细胞前病毒 提取 . 43 套式 增各试验马不同时期外周血白细胞前病毒 . 43 式 增各试验马不同时期外周血白细胞前病毒 因 . 44 物的克隆测序 . 44 列的分析 . 44 3 结果 . 44 疫及攻毒后各试验马不同时期外周血白细胞前病毒 扩增及克隆 . 44 疫及攻毒后各试验马不同时期外周血白细胞前病毒 因的扩增及克隆 . 45 疫及攻毒后各试验马不同时期外周血白细胞前病毒 序列比较分析 . 45 疫及攻毒后各试验马不同时期外周血白细胞 前病毒 列变化规律 . 55 疫及攻毒后各试验马不