荧光定量PCR仪器简介-liuyippt课件

.,荧光定量PCR仪器简介,湖南圣湘生物科技有限公司刘昳,.,主要内容,.,.,945772,水浴锅PCR,荧光定量PCR,金属浴锅PCR,1、PCR仪的发展历史,.,2、荧光定量PCR仪的发展历史,Perkin-ElmerCetus仪器公司推出第一台热循环仪,ABIPrism7700第一个高通量的实时荧光PCR仪,Bio-RadiCycler,2000年后更多质优价廉的仪器进入市场，通量更高,1985.11,1996年,1998年,1999年,2000年,ABI推出7900HT荧光定量PCR仪,Roche推出第一台全自动荧光定量PCR仪Lightcycler1.0,.,3、荧光定量PCR仪的组成,一台PCR仪主要由控温系统和光源系统两大组件构成。,.,4、荧光定量PCR仪的原理,Taqman探针,.,4、荧光定量PCR仪的原理,.,5、荧光定量PCR仪的应用,基础科学研究疾病检测与治疗检测、预后优生优育及遗传筛查基因表达分析临床医学应用肿瘤分型/耐药性评估食品卫生检疫及安全评估,医院检验科、感染病科等疾控中心血站、血液中心研究所等机构食品监督管理局海关进出口检疫,.,高端市场,低端市场,5、荧光定量PCR仪的市场情况,.,高通量,高速度,自动化,灵活化,4,3,2,1,互联网化,5,6、荧光定量PCR仪的发展趋势,.,.,1、硬件组成,光学系统：激发光源和检测系统；热循环系统：加热和制冷系统；信号处理系统；,.,2、激发光源比较,.,Laser:高强度,波长范围窄Tungstenlamp:中等光强,波长范围宽Lightemittingdiode:低的光强，波长范围窄,2.激发光源比较,.,2.激发光源比较,.,3、检测装置比较,.,3、检测装置灵敏度比较,PMT可以检测到很宽的波长范围，并对信号有放大作用CCD检测范围宽,易受背景信号噪音影响,整体检测时间较长光电二极管可以检测到很宽的波长范围,检测灵敏度低,冷CCD装置与普通CCD相比：冷CCD能降低图像噪音，提高图像质量和灵敏度。,.,3、检测装置PMT和CCD检测原理比较：,光信号得以扩增.获得更大的检测信号和更高的灵敏度无边缘效应,光子释放出电子，使检测器留下一个带正电荷正电荷记数作为检测信号信号没有得以放大有边缘效应,.,4、加热系统：空气加热,速度快；管间温度均一性好；无需金属的精密加工；成本低；对环境温度要求高：不能低于室温（15-35）;灵活性差：不能做温度梯度；样本数量少（罗氏毛细管32个）。,.,金属热块的加热和降温分别通过电阻丝和半导体来控制。特点：温控范围大（4to99），均一性（0.5）；灵活性好：可以做温度梯度；样本数量多（96孔和384孔)；但其加热速度比空气加热稍慢。,4、加热系统：半导体加热系统,.,风扇制冷压缩机制冷半导体制冷,5、制冷系统,.,6、荧光定量PCR仪的性能目标,.,.,PCR仪的家族成员,进口美国应用生物系统公司（ABI）美国伯乐（Bio-rad）瑞士罗氏（Roche）美国安捷伦（Agilent）德国凯杰（Qiagen）德国艾本德（Eppendorf）韩国柏业（Bioneer）,国产杭州博日（Bioer）上海宏石（Slan）西安天隆（Tianlong）上海枫岭（Funglyn）厦门安普利（Amplly）广州达安（DA）上海科华（Fluocycler）,.,.,2007年：ABIStepone/Plus,2010年：ABIViiA7,.,ABI仪器光学路径,.,Rox：(5-carboxy-x-rhodamine)5-羧基-X-罗丹明,样本1,样本2,Rox的功能：1）校正单次反应运行中由于泡沫或蒸发/冷凝而导致的信号改变；2）为故障分析提供一项强有力的诊断工具：每次循环采集参比染料信号，不受PCR反应影响；3）均一化校正由于移液误差或蒸发所导致的批内体积差异；4）均一化校正批间体积差异，提供更连续一致的批间重复Ct值。,ABI仪器：校正染料ROX,.,ABI仪器：校正染料ROX的效果,.,各款ABI主流荧光定量PCR的特点,.,罗氏定量PCR仪大家族,Lightcycler1.5,Lightcycler2.0,Lightcycler480,Lightcyclernano,Lightcycler1536,罗氏CobasAmpliprep,.,空气后通过加热元件加热，热空气经过风扇的作用进入循环腔内；通过风扇的调节来保证空气循环和温度的均一性；加热时，风扇低速运转从而使得腔内的温度均匀；冷却时，风扇高速运转使加热枪和毛细管降温。,RocheLC1.5/2.0荧光定量仪特点,.,RocheLC1.5/LC2.0性能参数,.,RocheLC480热循环系统组成和特点：ThermalBlockCycler包括了样本底座（96孔或384孔），Peltier元件，配合Therma-BaseTM热均衡器，银质散热块和电子元件。Blockcyclercover(热盖）Multiwellplateloader,Multiwellplatedetector,Multiwellplatebar-codescanner(条形码扫描装置），BlockCyclerdoorwithfans.,热盖,微孔板模块Peltier半导体加热单位冷却装置Therma-BaseTM,RocheLC480,.,RocheLC480特有的温控元件Therma-Base,Therma-Base是一种热均衡器。封闭的真空夹层，内壁为灯芯式结构，存贮工作液；通过一系列的蒸发和凝结过程来调节控制温度,提升导热效率，提高孔间温度均一性，孔间温度的精确度0.1C快速冷却和加热速度Heating:(4.8)C/sCooling:(2.5)C/s整个板的精确PCR结果96孔模式1hour384孔模式40min,多孔板座,Peltier元件,冷却装置：银质散热鳍,Therma-Base层,.,光源：Xenon-lamp,RocheLC480光学系统组成及特点激发和发射滤镜轮：5个激发波长和6个检测波长；半峰带分别为25-40nm和20nm；,氙灯：激发波长从330nm到630nm；需预热两分钟；平均寿命至少500个小时；易更换。,冷CCD(1204x1344),温度被控制在10左右，降低了热噪作用。,RocheLC480光学系统特点,.,光路特点：如何解决边缘效应？,光源太近：光强度够了，但边缘光信号根本无法收集；,光源太远：整体光强度不够，且边缘信号弱。,.,RocheLC480独有的compactinstrument:,两个解决办法：Fieldlens:具有很好的光透性和光收集能力；使得激发和检测光的保持良好均一性；光线以近乎直角的角度经过热盖孔射到每个孔中；2.特殊的光路设计使样本与CCD达到最佳光程位置，光经过多次折射后到达检测系统。,孔间无阴影效应很好地收集孔边缘光，不会造成边缘光的失真或变化,保证了整板的均一性和灵敏度,.,MyIQ单色PCR,Bio-radIQ5,Bio-radICycler,MJOpticon2,Bio-radCFX-96,伯乐定量PCR仪大家族,.,Bio-RadRealTimePCR仪性能特点,.,安捷伦定量PCR仪大家族,StrategeneMx3000P,StrategeneMx3005P,2001年，StrategeneMx3000P,2007年，安捷伦收购Strategene。,.,Mx3000p荧光定量PCR仪硬件,.,热循环系统特点：半导体控温制冷（Peltier控温）热盖加热升降温速度2.5/s温度均一性和准确性：0.25,.,光学系统特点：,1使用PMT光电倍增管（提高灵敏度且无边缘效应）2光纤维扫描激发和检测3光源：卤钨灯,.,扫描式检测模式：,恒定的强度，没有位置的相关性；,1.所有96孔都用相同强度的光扫描，因此没有激发的差别2.所有96孔的发射光都经过相同的距离传输给PMT，因此没有检测距离的差别,避免了个样品间的光程差，无需内参校正。,整板读取3.5秒；4通道的扫描16秒；5通道的扫描要20秒选择不同的染料后，分别扫描滤镜轮转动16bitPMT检测荧光,.,ROTORGene3000,ROTORGene6000,ROTORGeneQ,凯杰定量PCR仪大家族,2008年，Qiagene收购Cobbert。,.,LED激发,PMT检测,反应仓-空气流动使温度上升下降,.,主要特点：空气加热，升温（15/s)和降温(20/s)速度快；每通道独立LED灯光源，和滤光片，多达6个通道（365-680nm激发，460-750nm检测）；PMT检测，增益可调；提供Rotor0DiscTMOTV进行光学温度校验；36-wellRotor,72-wellRotor,0.2ml普通PCR管，0.1ml四联管；,Rotor-GeneQ实时荧光定量PCR仪-Qiagen,.,其他进口PCR仪,艾本德Mastercycler,柏业ExicyclerTM96,.,LINE-GENEFQD-33A,LINE-GENEFQD-66A,LINE-GENEFQD-K,LINE-GENEFQD-96A,博日定量PCR仪大家族,.,博日PCR仪器加热模块,.,激发光LED,Longlifemaintenance-freeultra-bright,荧光检测PMT,LowTemperatureDriftultra-sensitiveHigh-stable,博日PCR仪器光源系统,.,底部扫描方式，全板扫描时间少于5秒,博日PCR仪器荧光采集,.,SLAN-48,SLAN-96P,SLAN-96R,宏石定量PCR仪大家族,.,宏石slan荧光定量PCR仪,光源：LED灯检测装置：PMT(光电倍增管）温控系统：半导体加热/制冷检测动力学范围：100-1010反应体积：10ul-100ul可选择的荧光染料：FAM,SYBER;VIC,HEX,JOE,TET;ROX,TEXRAD,CY5样本容量：48个（20ul-100ul)SFDA,CETUVISO13485认证（2003）,软件系统根据每管荧光值大小，自动选择增益值，无需手动设置；检测灵敏度高，荧光背景值低，无需光学及背景校正。,.,Slan的独特检测模式：独立光纤传导扫描侧面检测,提高了荧光采集效率，减小孔间荧光干扰侧面检测，相对顶部透光，降低了对管盖透光性的要求,.,.,Genelight2400,Genelight9800,安普利定量PCR仪大家族,.,达安DA7600,达安PCR仪,光源：LED灯检测装置：PMT(光电倍增管）温控系统：半导体加热/制冷检测动力学范围：100-1010反应体积：10ul-100ul激发波长：470nm检测波长：530nm、640nm、710nm温度范围：30-99可选择的荧光染料：FAM,SYBER;LC640NHSESTER;CY5.5,TYE705样本容量：48