【毕业学位论文】（Word原稿）猪H-FABP基因和CAST基因的多态性及其与肉质性状关系的研究动物遗传育种与繁殖论文

密级 : 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 猪 因和 因的多态性 及其与肉质性状关系的研究 in s I 缩略语英汉对照表 缩略语 英文 中文 脏脂肪酸结合蛋 白 蛋白酶抑制蛋白 基因 he 胞视黄醇结合蛋白 he 胞视黄醇酸结合蛋白 合酶链式反应 制性片段长度多态性 增片段的长度多态性 量性状位点 记辅助选择 低密度脂蛋白 密度脂蛋白 机引物扩增多态性 链构型多态性 链构型多态性 离子释放通道 肌面积 背最长肌 内脂肪 膘厚 D) 背最长肌肉色色值 水力 水量 D) 背最长肌肉色评分 滴水损失 切力 MT D) 嫩度 D) 大理石纹 要 本文选 取大 白猪 242头（ 屠宰 27头）和中畜黑猪 159头（ 屠宰 38头）为试验动物 ， 利用 脏脂肪酸结合蛋白（ 因和 钙蛋白酶抑制蛋白（ 基因 进 行了研究。并对屠宰个体的 12 种肉质性状进行了测定和分析，在此基础上，进一步分析了 结果如下 ： 1、两个猪品种中 在大白猪和中畜黑猪 中的频率分别为 的频率为 的频率为 在大白猪和中畜黑猪中的频率分别为 频率为 2、 因 (1)大白猪群体中， 肌内脂肪含量显著相关； 大理石纹显著相关。 (2) 中畜黑猪群体中， 剪切力 显著相关 ； (3)总 体水平上， 肌内脂肪含量 显著相关 。 从本试验的结果看： 3、 (1) 大白猪群体中， 著相关 。 (2) 总体 水平上 ， 肌内脂肪含量显著相关 ,倍型肌内脂肪含量最高， 4、各肉质性状间的相关分析 大理石纹与肌内脂肪、 呈极显著正相关（ P大理石纹与剪切力呈极显著负相关（ P肌内脂肪与剪切力呈显著正相关（ P肌内脂肪与水分呈极显著负相关（ P剪切力与 P 结果表明，本试验对 关键词 ：猪， 因， 因， 质，相关分析 he 42（ 7） 59（ 8）on of of as 1、 in in In 2、 1)MF (2) FV of (3) on of 3、 1) FV (2) on MF 4、 MF HU P; FV P; FV PM（ P; P. As a an is MF is 录 第一章 引 言 . 1 肉质性状的研究进展 . 1 述 . 1 传育种中常用的分子标记 . 1 子标记在猪遗传育种中的应用 . 1 肉质性状候选基因的研究进展 . 2 肌素 (因 . 2 胖基因（ 其受体（ R）基因 . 2 磷酸腺苷激活性蛋白激酶 3亚基基因（ . 3 钙素基因（ . 3 素敏感酯酶基因（ 脂蛋白酯酶基因（ . 3 因 . 3 族概述及其基因的研究进展 . 4 述 . 4 因的研究进展 . 4 蛋白酶系统 . 6 述 . 6 钙蛋白酶的调节 . 7 蛋白酶系统与嫩度的关系 . 8 因的研究进展 . 8 质性状间相互关系的研究 . 10 研究的目的和意义 . 11 第二章 材料与方法 . 12 验材料 . 12 验猪种来源： . 12 要仪器设备 . 12 具酶及主要试剂 . 12 要药品及试剂的配制 . 13 V 析所用引物 . 14 验方法 . 14 液 取 . 14 度和纯度的检测 . 15 因和 因的 测 . 15 物溶液的配制 . 15 佳反应条件的确定 . 16 增产物检测 . 16 制性内切酶消化及多态性分析 . 16 要肉质性状的测定 . 17 肉大理石纹的评定 . 17 内脂肪含量的测定 . 17 肉嫩度的测定 . 17 肉 测定 . 17 肉颜色的测定 . 18 计分析方法 . 18 因频率和基因型频率的计算 . 18 计分析模型 . 18 第三章 结果与分析 . 20 因组 提取 . 20 因的 测 . 20 物的扩增结果 . 20 因的 测结果 . 21 因的 测 . 23 物的扩增结果 . 23 因的 测结果 . 24 因频率和基因型频率分析 . 26 品种 因的 基因型及基因频率分析 . 26 品种 因的 基因型及基因频率分析 . 26 因与肉质性状的关联分析 . 27 白猪 因的不同酶切位点对肉质性状的影响 . 27 中畜黑猪 因的不同酶切位点对肉质性状的影响 . 29 因各酶切位点的品种效应对肉质性状的影响 . 31 因各酶切位点的基因型效应对肉质性状的影响 . 32 因与肉质性状的关联分析 . 33 白猪 因的不同酶切位点对肉质性状的影响 . 33 畜黑猪 因的不同酶切位点对肉质性状的影响 . 34 因各酶切位 点的品种效应对肉质性状的影响 . 36 因各酶切位点的基因型效应对肉质性状的影响 . 37 质性状间的相关分析 . 38 第四章 讨 论 . 40 析 . 40 因的 肉质性状的关系 . 40 因的 肉质性状的关系 . 41 质性状相互关系的研究 . 41 响肌肉品质测定的因素 . 42 第五章 结 论 . 43 参考文献 . 44 附 录 . 50 致 谢 . 51 作者简历 . 52 中国农业科学院硕士学 位论文 第一章 引 言 1 第一章 引 言 肉质性状的研究进展 述 随着人们生活水平的提高，猪的肉质问题逐渐引起了生产者和消费者的重视，其在猪育种工作中的重要性逐渐得到提高。畜禽的大多数重要经济性状，包括肌内脂肪（ 量和嫩度，都是数量性状，其遗传基础受多基因控制。通常将作用较大 的数量性状位点称作主效基因（ 。近年来，分子生物学和分子克隆技术的发展，为畜禽遗传改良带来了新的机遇。猪的肉质性状是一个重要的经济性状，在提高生长速度和瘦肉率的选择中，常伴随着肉质的下降。以往的研究结果表明：在瘦肉猪生产中，产肉率与肉质间存在一定的拮抗关系（小迟忍，1986）。猪的肉质性状与生长性状和胴体性状间常常表现为负的遗传相关。通过猪遗传背景的研究使人们意识到：可以利用标记辅助选择（ 畜禽的数量性状进行遗传操纵，使用基因技 术辅助选种对改善肉的品质很重要。因此，分子标记在猪的遗传育种中发挥着巨大的作用。 猪的肉质性状包括很多方面。一般来讲，肉质包括肌肉质量、背膘质量、加工质量和食用质量（苏玉虹等， 2000）。常用的检测指标有：肌内脂肪、剪切力、大理石纹、肉色、 、水分、滴水损失等。 传育种中常用的分子标记 通过外形选择、遗传参数、选择指数等进行选种的育种方法使动物育种取得了很大近展，但由于许多性状测定时间长，受环境、营养水平等因素的影响，使选种准确性受到较大影响。 20世纪 80 年代以来，分子育种技术迅速发展，通 过微卫星扫描或是候选基因法寻找数量性状位点的遗传标记或与之连接的 记，应用于标记辅助选择，为动植物的遗传改良提供了新的技术手段。 自 1980 年美国学者 现 作为遗传标记以来， 子标记技术发展很快，目前出现的 子标记可分为三类：基于 标记。如 ；重复序列 记，如卫星 卫星 卫星 这类标记多态性丰富，需要专一性探针。 列多态性标记（ 这类标记有可能达到生物基因组多态性的最大极限。 子标记在猪遗传育种中的应用 分子标记在猪遗传育种中的应用主要包括对影响猪数量性状的主效基因的检测及数量性状位点（ 定位，标记辅助选择和标记辅助导入以及转基因技术、度量群体内遗传变异、分析畜群之间的遗传距离和亲缘关系等。 中国农业科学院硕士学 位论文 第一章 引 言 2 记辅助选择 把主效基因或数量性状位点（ 分子标记提供的信息作为常规选择的补充，称为标记辅助选择（ 从分子水平进行并能真实的反映该性状的基因型，具有高准确性，可用于早期选种。这样就避免了常规选种的不准确性，缩短了世代间隔。 主要的胴体、肉质性状及其遗传力 虽然目前对某些肉质性状的考虑不象牛肉那样重要，但随着现代肉食加工和销售业的发展，以及 产肉性能的遗传改良，肉质指标越来越重要，现在已有将肌肉 、系水力纳入分级标准的建议（王立贤， 2000）。肉质是一种复合性状，表 出了猪的一些主要肉质性状及其遗传力。 表 猪主要肉质 性状的分类及其遗传力 （丁能水， 2000） of of in 状分类 性状名称 平均遗传力 估计范围 工品质 1 9 肉品加工产量 8 系水力（滴水损失） 官品质 嫩度（仪器测定和主观评定） 6、 汁性 8 肌内脂肪含量 0 肉色（光反射测定） 7 猪肉风味（专家评分） 6 脂肪品质 背部脂肪硬度（仪器测定） 公猪气味强度（主观评分） 肉质性状候选基因的研究进展 肉质的定义在各个国家有所差异，但广为接 受的是 994)的定义 。肉质是一个综合性状，度量肉质性状的主要指标包括： （ 系水力、肌内脂肪含量、嫩度、肉色、大理石纹等。研究表明，肉质质量 10%变异与遗传有关。肉质性状大多属于数量性状，其遗传基础受多基因控制。 肌素 (因 肌肉生长 抑制素基因（ 又称骨骼肌生长分化因子 8(该基因是骨骼肌生长发育的抑制因子，可能是影响猪瘦肉率的候选基因之一。属于 因是该家族中首次被发现的控制肌肉大小和嫩度的主效基因。研究表明，将该基因剔除后可使骨骼肌重量增加 2。 胖基因（ 其受体（ R）基因 中国农业科学院硕士学 位论文 第一章 引 言 3 肥胖基因为常染色体隐性遗传。猪的肥胖基因定位于 18 号染色体上 ( et 1996)， 析表明：肥胖基因在脂肪组织、肝、肾、心脏等器官中都有 表达 (戴如娟等，1997)。肥胖基因的表达产物 一种能调节体内脂肪储量、能量代谢及体重的内分泌因子。并且 表达与猪皮下脂肪积累有关。猪的肥胖（ 因和肥胖受体（ R）基因分别定位于 18 6目前为止猪 因共发现四个突变位点。刘娣等发现 因第二外显子的多态与瘦肉率相关。另外， 可以调节黑素皮质受体的作用（ et 1996）。 磷酸腺苷激活性蛋白激酶 3 亚基基因（ 研究发现 腺苷一磷酸激活蛋白酶 (激活后能阻止糖元合成和糖元降解，在肌肉提取液中，正常猪（ rn/ 性比非正常猪（ 高约 3 倍（ et 2000）。编码 调节骨骼肌能量代谢中起关键作用。因被定位在 15 号染色体 把其作为 候选基因。通过 析方法对rn/ N 纯合子进行研究确定了整个 因的编码序列。发现了 7 个核苷酸差异，4 个错义突变。对不同品种猪的 状 的基因组 7 个 行筛选，发现了 5个不同的 位基因，但是只有 变与 关，导致了汉普夏猪 异的出现，被认为是极有可能的肉质数量候选基因位点。 钙素基因（ 降钙素基因（ 于 域。钙离子浓度直接影响蛋白酶活性，浓度越高酶活性越大，肌纤维水解多，嫩度大；此外，肌纤维的收缩受到钙离子浓度的控制，浓度高，收缩程度大，嫩度大。降钙素主要调节钙离子浓度平衡，降低血钙水平，从而改变肉的嫩度。 素敏感酯酶基因（ 脂蛋白酯酶基因（ 激素敏感酯酶（ 动物体脂肪分解的关键酶（ F et 1995）。 调节区域的调节位点可调节 性进而影响脂肪组织的分解（ J et 1994）。猪 因长 10 11括 9 个外显子编码 171 个氨基酸（ et 1999）。 因定位于 u F et 1992 )。 （ 1999）研究了 因第 8 外显子的多态性。 A 报道了 因外显子 I 的 不同品种中的分布情况（ et 1998）。推测此多态性可能与猪胴体性状背膘厚、瘦肉率相关，也可能与猪肌内脂肪含量相关，是猪脂肪沉积性状的主要候选基因之一。 脂蛋白酯酶催化 (蛋白质相连的甘油三酯水解，与激素敏感酯酶协同作用。 责脂肪的分解， 责脂肪的储存。猪的 因定位于 14 号染色体 过 因的 态性，从理论上推测，这些 态性也有可能与猪肉肌内脂肪含量有关（吴珍芳等， 1998）。 因 中国农业科学院硕士学 位论文 第一章 引 言 4 哺乳动物肌纤维在胚胎形成过程中受到生肌调节因子 因家族的调控，控制整个肌肉的发育过程。 节中胚层细胞分化成为肌细胞，再由肌细胞融合形成肌纤维。 产肉性状候选基因，猪 因位于 W et 1998b; L et 1995)。包括 3 个外显子，两个内含 子。杨又兵等研究发现，在 2000 年资源家系 138 头大白梅山猪 因的多态性与眼肌 、股二头肌 呈显著性相关；在 2002 年 81 头大白梅山猪猪中其多态性与股二头肌大理石纹呈显著性相关 (杨又兵， 2003)。 族概述及其基因的研究进展 述 家族是细胞质内的脂肪酸结合蛋白，存在于许多细胞类型的细胞溶质中（ et 1985; et 1987）。它们的 作用是转运脂类或参与脂类代谢，调整游离配位体的浓度（ et 1995）。 一组同源性小分子胞质蛋白质，分子量为14有 126 列，对脂肪酸具有特别的亲和力，它们可以结合多种配体。 助细胞内脂肪酸转运到特定的细胞器或者细胞膜中；参与细胞内脂肪酸的摄取；贮存脂肪酸及其 ，保护细胞膜和酶，调整某些酶类的底物浓度（ . et 1989; et 1989; . et 1989）。 脂肪酸和 接或者间接地参与包括基因表达在内的细胞过程的调节（ et 1993）。 目前已经发现 族有 15 种之多，分别是：肠型 (心脏型 (脂肪细胞型 (肝脏型 (脑型 (表皮型 (回肠型 (髓磷脂型 (细胞外脂肪酸结合蛋白 ( 睾丸型（ S）、 肾型 (肪酸结合蛋白 以及 ( (4 个成员 ( et 2002)。 不同类型的 不同组织和细胞中表达。在哺乳动物中有两种 因被作为肌内脂肪含量的候选基因，分别是心脏脂肪酸结合蛋白基因（ 脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因（ (et 2003)。 因的研究进展 结构 和功能 称 族中最普遍的一种类型，它是一个 15蛋白质，主要在几个对脂肪酸高度需求的组织中表达，如在心肌、骨骼肌和泌乳的乳腺中表达 (et 1995)。其