western blot 法检测大鼠肝组织血清蛋白的表达变化.doc

Western-blot1、 实验目的1、 用于目的蛋白的表达特性分析2、 目的蛋白与其他蛋白的相互作用2、 实验原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测的一项技术。与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Western Blot显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。三、 实验器材及试剂1、 器材：（1）可调移液器P1000、P200和P20，经消毒的相应的盒装吸头（2）经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及水浴锅用试管架（3）定时器，记号笔，一次性口罩和筒纸（4）于冷室中预冷的1.4万转台式离心机（5）PH试纸（6）分光光度仪，石英比色杯（7）烧杯，量筒，棕色试剂瓶（8）0.45um滤纸2、主要试剂(1)一抗：小鼠抗大鼠多克隆抗体（清蛋白，分子量66kD）(2)二抗：羊抗小鼠IgG-HRP(3)定蛋白试剂盒：南京建成生物工程研究所。(4)四甲基乙二胺（TEMED）:Sigma分装。（5）RIPA(100ml):NaCl 0.88g，NP-40 1ml，10%SDS 1ml，1MTris（PH7.2）5ml，0.5,MEDTA(PH8.0)1ml,加去离子水至100ml。（6）Complete mini液：每片药片加去离子水1ml溶液。（7）0.1M PMSF 5ml：称取PMSF 87mg，用异丙醇溶解，使终体积为5ml。(8)2M Tris（100ml，PH6.8）:Tris 24.23g,用HCl调PH至6.8，终体积为100ml。（9）3M Tris（100ml，PH8.8）：Tris 36.34g,用HCl调PH至8.8，终体积为100ml。（10）10%SDS（50ml）：SDS 5g，去离子水溶解至50ml。四、实验步骤（一） 组织匀浆的制备1、称取大鼠肝组织100mg,放入8ml离心管中，加入RIPA 900l,冰浴匀浆（超声）。2、匀浆后立即加入PMSF 100l,转移至1.5ml离心管中。加入Complete液40l，4离心，10000rpm，10分钟，收集上清液。3、4，10000rpm再次离心10min。上清液分装，-70保存（也可不过夜）。另取少量上清液测蛋白含量。（2） 蛋白含量的测定及上样量的计算（考马斯亮蓝法）原理： 考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。1、 样品的稀释 样品采用25倍稀释，即2ul的样品中加双蒸水48ul即可（具体要根据样品的浓度适当稀释）2、 显色剂（试剂盒附带说明）的稀释将贮备液1：4稀释3、 操作 空白管 标准管 测定管 蒸馏水（ml） 0.050.563mg/ml标准蛋白（ml） 0.05 样品（ml） 0.05 显色剂（ml） 3.0 3.0 3.0混匀，静置10min，于595nm处，以空白管调零，测定各管吸光度。4、 计算蛋白含量(g/L)测定管吸光度/标准管吸光度标准管浓度(g/L)根据所求样品的实际蛋白含量，求得在20l总体积中的样品体积，保证每个样品的上样量为120g。2、 Western blot法检测肝脏清蛋白的表达（1） 样品的处理（1）将分装好的样品从冰箱中取出，用RIPA进行稀释。（2）16l稀释液中加入上样缓冲液4l，混匀。（3）95水浴中煮5分钟，冷却后可上样。以上步骤均由老师代为完成，本实验学生实验部分从下面开始。写出未实验部分，为了熟悉整个Western-blot实验的流程！（2） SDS-PAGE电泳：SDS-PAGE的原理：丙烯酰胺（Acr）和 甲叉双丙烯酰胺（Bis），在过硫酸铵（催化剂）和四甲基乙二胺（加速剂）的作用下可以聚合成聚丙烯酰胺凝胶。PAGE根据缓冲液pH值及凝胶浓度是否相同，可以分为连续系统和不连续系统两种。 前者利用电荷效应、分子筛效应进行电泳；后者利用浓缩效应、电荷效应和分子筛效应进行电泳。本实验采用的是后一种方法。凝胶层的不连续性：不连续系统的凝胶包括浓缩胶和分离胶。浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小，移动快。而在小孔胶中泳动时遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。SDS与还原剂并用, 通过加热可使蛋白质解离，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，减除或消除了不同蛋白质分子天然电荷的差异，SDS-PAGE只是根据分子大小不同进行分离。实验器材及试剂：1、 器材：（1）可调移液器P1000、P200和P20，经消毒的相应的盒装吸头（2）Protean或 16cm垂直电泳系统（Bio-Rad）或SE600/400 16cm电泳系统（Hoefer），包括电泳槽、玻璃板、灌胶架、玻璃板间隔板、玻璃板夹等（3）转移用滤膜、剪刀、定时器2、试剂：（1）丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺 （2）1M Tris缓冲液(pH=8.8) （3）1M Tris缓冲液(pH=6.8) （4）N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) （5）10%过硫酸铵(APS) （6）10%SDS （7）双蒸水1、 安装电泳装置，检查是否漏水。2、 配制10分离胶（灌胶约2/3体积），蒸馏水液封。10分离胶配10ml方如下：蒸馏水2.7ml 10SDS0.1ml1MTris(pH8.8)3.8ml30成胶液3.3ml10APS100lTEMED8l3、 待胶凝后倾去蒸馏水4、 配5堆积胶6ml，灌胶至平板顶部，插入梳子。配胶方法如下：蒸馏水4.1ml 10SDS0.06ml1MTris(pH8.8)0.75ml30成胶液1.0ml10APS60lTEMED10l5、 胶凝后拔出梳子，倒入电泳缓冲液，上样（样品上样量为10ul，Marker为预染Marker，上样量为5ul，不需要处理）。6、 接通电源开始电泳，60V、45分钟后转110V电泳90分钟后停止电泳。（3） 转膜及封闭1、 准备平皿两只：一个装去离子水，一个装转移缓冲液。2、 小心将胶取下，放入转移缓冲液中平衡15分钟左右；另外裁剪两块略小于胶的NC膜（有的NC膜需要区分正反，转膜时毛面和胶接触），大小略小于胶，将其浸入去离子水中摇晃5min后放入转移缓冲液中；另裁剪略小于胶的厚滤纸6张，浸于转移缓冲液中。3、 按顺序安装好转膜装置（即制备“三明治”：负极-三层滤纸-胶-NC膜-三层滤纸-正极），并完全拍尽气泡，保证低温条件下转膜（可将转膜装置周围加入大量冰块），400mA恒流转膜60min左右。4、 转膜结束后，倾去转移缓冲液，拆除转膜装置。取出NC膜，并剪角以辨认正反上下。5、 PBST洗涤5分钟。6、 37条件下，5脱脂奶粉封闭1h。（2） 加入一抗及二抗1、 5的脱脂奶粉稀释一抗（根据预初结果本次为1：1000稀释），配制12ml（两块膜）。2、 滴加一抗于塑料小盒中（一块膜大约滴5ml稀释好的一抗），将膜小心覆盖于一抗上（有蛋白的一面和一抗接触），将小盒置于搪瓷盆内，并在搪瓷盆中加水少许,盖好盆盖，4过夜（或37孵育2h ）3、 将膜从小盒中取出，0.1M PBST洗涤4次，每次5分钟。4、5的脱脂奶粉稀释二抗（根据预初结果本次为1：5000稀释），配制10ml。滴加二抗于小盒中，膜小心覆盖于二抗上。5、 将小盒置于搪瓷盆内，并在搪瓷盆中加水少许,盖好盆盖，37孵育45min。6、 将膜从平皿中取出，0.1M PBST洗涤4次，每次5分钟。（6） 实验结果（该实验由于抗体原因，检测的是GDPH）：（七）结果分析：观察可以发现，从左起第一、第三个条带颜色较深，说明这两组蛋白含量要较其它高。第二个条带较其它条带稍窄些。出现宽窄不一的原因可能是：凝胶在聚合的时候没有聚合均匀，所以在灌胶时一定要混合均匀，动作要轻缓；右起第四个条带上有一个白点，可能是由于凝胶中有气泡所致。注意事项： （1） 配置裂解所用的缓冲液应采用类似于生理条件的缓冲液，需考虑：选择合适的PH，以保证待分离蛋白在此PH条件下稳定缓冲液预冷至4离子强度常用0.1-0.2mol的NaCl或KCl。（2） 膜蛋白的提取难度比较大，提取时可以适当增加去污剂的种类和含量