【毕业学位论文】茶叶中亚硝酸盐检测技术研究硕士学位论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 茶叶中亚硝酸盐检测技术研究 士 研 究 生：古小玲 指 导 老 师：鲁成银 研究员 申请学位类别：农学硕士 专 业：茶学 研 究 方 向：茶叶质量安全与检测 培 养 单 位：茶叶研究所 研究生院 提交日期 2007 年 6 月 s. Gu u 2007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 茶叶中亚硝酸盐检测技术研究 论文作者 古小玲 指导老师 鲁成银 培养单位 茶叶研究所姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 屠幼英 研究员 硕士生导师 浙江大学 茶学 评阅人尹军峰 副研究员 硕士生导师 中国农业科学院茶叶研究所 茶学 答辩主席 龚琦 教授 博士生导师 浙江大学 茶学 朱诚 教授 博士生导师 浙江大学 生物技术陈亮 研究员 博士生导师 中国农业科学院茶叶研究所 茶学 成浩 研究员 博士生导师 中国农业科学院茶叶研究所 茶学 答辩委员江和源 副研究员 硕士生导师 中国农业科学院茶叶研究所 茶学 答辩时间、地点 2007 年 6 月 15 日，茶叶所会议室 记 录 杨珍伟 摘 要 食品质量安全越来越受到人们的关注。亚硝酸盐具有致癌性，食用过量亚硝酸盐会发生中毒事件，因此，亚硝酸盐也是广 大消费者关注的食品质量安全因素之一。迄今，茶叶中是否含有亚硝酸盐及其检 测技术尚未见报道。本文采用比色法对茶叶中亚硝酸盐检测技术进行了研究，其 原理是将试样经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺 酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准比较定量。主要研究结果如下： (1)通过食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法（ 茶叶上的应用考察，发现茶叶在前处理后滤液是黄 绿色，加显色剂后并不呈现特征的颜色，干扰显色效果，影响吸光度，降低回收 率，从而影响测定结果。因此，食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定方法（ 法应用于茶叶中亚硝酸盐的测定。 (2)本研究建立的茶叶中亚硝酸盐检测方法，最佳测试参数为茶叶试样在 70的提取温度和水浴温度下浸提 30 碱式乙酸铅饱和溶液对滤液进行脱色，在滤液中加 0.1 酸溶液（4.5 ）除去滤液 残留的碱式醋酸铅，并保持溶液在酸性的条件下显色。对氨基苯磺酸溶液和二盐酸 二胺溶液显色在 120 方法回收率达 变 异系数为 具有快速、准确、经济且对设备条件要求不高，操作简单，适用于茶叶中的亚硝酸盐含量的测定。 (3) 应用此方法对 112 个茶叶样品进行了测定，结果表明：不同茶类中亚硝酸盐含量差异明显。无公害绿茶中亚硝酸盐含量平均值为 色食品绿茶中亚硝酸盐含量平均值为 平均值来看来无公害食品茶叶中亚硝酸盐含量比绿色食品和有机食品茶叶高，可能与氮肥施用量有关，将来可否 以此作为判定无公害、绿色食品、有机食品绿茶的指标有待进一步研究。珠茶中亚硝酸盐含量 mg/间，平均值为 茶的亚硝酸盐的含量在 mg/间，平均值为 mg/茶中亚硝酸盐含量在 间，平均值为 mg/龙茶茶样中亚硝酸盐含量在 间，平均值为 mg/洱茶变化范围为 086mg/均值为 mg/ 关键词 亚硝酸盐 比色法 茶叶 局限性 参数 测定 I on is of is of of At to by of as 1. T in of is of T be r 2. is is 0 C 0 of .1 ml of 4.5 L),be in of 20 - of is of to of (3) of 12 of is in is of as a to kg in ee in kg ea kg ea kg Puer in 86 610 目 录 第一章 绪论 . 1 人体的危害及其限量标准 . 硝酸盐的来源 1 硝酸盐对人体的危害 限量标准 . 3 光度法. 色谱法. 极谱法7 电位法酸 鲁米诺化学发光法 其他检测方法 8 .验原理与主要内容 10 验原理 . 主要内容 .术路线 二章 食品中亚硝酸盐的检测方法在茶叶上的应用考察 . 12 料与方法 . 12 器 . 试剂 . 料 .验处理 . 13 样处理. 测定 . 果计算 .果与分析 . 14 里斯试剂比色法蔬菜与茶叶回收率的比较 . 茶叶鲜叶与蔬菜回收率的比较 .论 . 14 第三章 茶叶中亚硝酸盐检测技术研究 . 17 料与方法 . 17 器 . 试剂 . 料 .验处理 . 18 品处理 . 脱色处理 . 定 .果与分析 . 合物的稳定性 茶汤脱色对回收率的影响 . 碱式乙酸铅饱和溶液体积的选择. 硫酸浓度的选择 浸提温度和浸提时间的选择21 品处理 精密度和准确度 标准曲线的绘制 论 23 第四章 茶样中亚硝酸盐检测技术的应用 . 料与方法 . 25 器 . 试剂 . 料 验处理 . 27 样处理. 色处理 测定 . 果计算 .果与分析 28 公害、 绿色食品、有机食品绿茶中亚硝酸盐含量比较28 茶和眉茶中亚硝酸盐含量29 压砖茶中亚硝酸盐含量 30 龙茶中亚硝酸盐含量31 洱茶中亚硝酸盐含量32 论 .五章 全文结论 . 34 参考文献 . 36 致谢 . 41 作者简历 . 42V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 第一章 绪论 硝酸盐的来源，对人体的危害及其限量标准 亚硝酸盐的来源 亚硝酸盐广泛存在于土壤、水域及植物中，如绿色蔬菜中，菠菜、甜菜、莴苣、芹菜及萝卜等亚硝酸盐含量较高。蔬菜中亚硝酸盐平均含量大约是 4 类 10 红，2 004） 。硝酸盐在某些细菌的还原作用下可变成亚硝酸盐。目前广泛采用的含氮农药和施用化学氮肥及含 氮工业废水、废渣对环境土壤和水造成污染，使其中亚硝酸盐含量不断增加。而 土壤则是水体、植物性食品亚硝酸盐的主要来源。 et 1980)发现，用硫化橡胶制成的包装产品，含有挥发性亚硝胺。包装贮藏过程中，通过与食品表 面接触或用其他添加剂间接加入，也能使得亚硝酸盐成为食品组分（丁之恩， 1994）食品、吸烟烟雾和污染的空气以及内在的来源如唾液和肠液等。人 体正常的生理过程中也能产生亚硝酸盐，虽然内源代谢形成的亚硝基化合物初始 累积一般可以代表摄入的亚硝基化合物的最大量，但尚不能用数量表示，饮食可 能对人体内部形成亚硝基物和含量起重要作用。 亚硝酸盐在食品加工过程中，主要用作发色剂、增香剂和防腐剂（魏红， 2004） 。如使用于肉类罐头和肉制品中，是肌肉组织中肌红蛋白 (在空气中 容易被氧化成褐色的肌红蛋白，通过肌红蛋白与亚硝酸的 一系列反应，则变成稳定的呈鲜红明亮的亚硝肌红蛋白(；在肉类制品中亚硝酸盐可抑制微生物增殖，与食盐并用更可增加抑菌效果，它对肉毒梭状芽孢杆 菌也能抑菌；同时亚硝酸盐对保持腌肉香味的稳定性有作用，有人对某些香肠制 品进行试验，认为对不经过烟熏工艺的制品，凡添加亚硝酸盐后的香味比不添加亚硝酸盐为好，与经过烟熏工艺者，二者间则无明显差别。腌制蔬菜时，一般也要 用亚硝酸盐来防腐；一些婴幼儿奶粉在经过特殊处理调制，改变其蛋白质组分， 使之更接近人奶的过程中，也会加入大豆蛋白，从而带进亚硝酸盐的成分。 亚硝酸盐对人 体的危害 亚硝酸盐对人体的危害主要表现有（魏红， 2004） ： （1）肠原性青紫症。当胃1中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 肠道功能紊乱或胃酸浓度降低时，可使胃肠道 内硝酸盐还原菌大量繁殖，此时大量食用硝酸盐含量较高的蔬菜（如大白菜、菠菜、球菜等），可使肠道内亚硝酸盐形成速度过快，机体来不及分解转化，亚硝酸 盐被大量吸收进入血液，将血红蛋白中的二价铁离子氧化为三价铁，使亚铁血红蛋白（正常）转变成高铁血红蛋白，而失去运氧机能，使皮肤粘膜青紫。其原理就 是亚硝酸盐的发色机理：亚硝酸盐为强氧化剂，进人人体后，可使血中低铁血红 蛋白氧化成高铁血红蛋白，失去运氧的功能，导致组织缺氧。若血中 200%的亚铁血红蛋白转变为高铁血红蛋白，则造成缺氧症状，引起呼吸困难、循环衰竭以及 中枢神经系统损害、血管扩张、血压下降等。（2） 生成具有致癌作用的亚硝胺。肉制品在加工过程中加入发色剂亚硝酸盐（硝酸盐也可被微生物还原成亚硝酸盐），在酸性条件下形成亚硝酸，再与由蛋白质分解产生的胺类物质反应形成亚硝胺 。特别是当肉类原料不新鲜时其中的蛋白质分解产生大量的胺类物质，则形成的 亚硝胺数量更多，毒性更大。许多蔬菜天然含有硝酸盐，食用时通过口中细菌的 作用被还原成亚硝酸盐，在胃肠道中也能与胺类物质作用，形成亚硝胺。霉变食品中也有亚硝胺类存在。 限量标准 近年来各地也发生了多起亚硝酸盐中毒事件。甚至在井水、婴幼儿的配方奶粉中也发现有亚硝酸盐含量超标的情况，所以 亚硝酸盐的使用量要严格控制。我国食品添加剂使用卫生标准中规定，在肉制品 。在肉制品中的最终残留量不能超过 50，肉罐头里不能超过 30，而婴儿配方乳粉中的残留量则不能超过（魏红，2004） 。对于食用的人来说，亚硝酸盐的每日允许摄入量是 。如果人体摄入 克就能导致死亡。 依据 1996 年联合国粮农组织/世界卫生组织联合食品添加物专家委员会(规定，硝 酸盐及亚硝酸盐之每日安全容许量(ac 别为 0kg 硝 酸盐计)与 0 mg/kg 亚硝酸盐计)，但 个月之婴儿。而如果饮用水之硝酸盐氮含量超过 10 mg/小于 6 个月 以下的婴儿及孕妇须特别注意，尽量勿饮用之或以之制备婴儿配方食品。欧盟建议亚 硝酸盐不得用于婴儿食品，而硝酸盐应予限制添加量。欧盟已于 2001 年订 定公告少数蔬菜（包括菠菜及莴苣）的硝酸盐限量标准。美国关于食品中亚硝酸盐研究和选择腌制剂委员会（1981）对每种食品的日摄入情况制定了表，定量地比较了人体从已知亚硝酸盐2中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 食物源中摄入亚硝胺的量。到目前为止摄入量 最大的是来自烟草产品，估计一个吸烟者每天平均摄入量为 17恰巧是油炸腌猪肉（0 天/人）的 100 倍（丁之恩，1994） 。 着社会的进步，人们生活水平的提高，食品安全受到广泛的关注。目前，人们在日常饮食中最关注的是其致癌性（Lo 1995） ，在人的肠胃中，亚硝酸盐还可与仲胺类物质反应，生成具有致癌性的亚硝胺类物质( et 995)。亚硝酸盐成为水质、食品等的重要监测项目之一。近年来，国内外已报道的测定方法很多，有紫外光度法、流动注 射分析光度法、增敏光度法、催化光度法、极谱法、色谱法、催化电位法、漆酚树脂传感器直接电位法、尿酸光度法 (1)重氮化光度法 目前适用于蔬菜、水果中硝酸盐和亚硝酸盐的检测方法是 品卫生国家标准汇编， 1997)，即在稀 酸介质中，对氨基苯磺酸）反应生成重氨盐，再与乙二胺（或联生成红色染料，用光度法进行测定法虽然有较高的灵敏度和选择性，但是所需试剂和显色反应稳定性较差，试剂本身都是毒性大的致癌物质，同时测定带来不便。若在酸性介质中使亚硝酸盐与磺胺嘧啶发生重氮化反应，再与乙二胺二氢氯化物偶合生成紫色偶氮染料，测定吸光度为 5 45 尔吸收系数为 快速、灵敏的测定饮用水的亚硝酸盐含量（袁东光，1995）。董存智等（1999 ）研究了在盐酸介质中微量的亚硝酸根与天青立了测量微量亚硝酸根的新方法。此方法的线形范围为（020）g/25表观摩尔吸光系数为 青含有一个伯胺基，在强酸性介质中易与亚硝酸根发生重氮化反应，而生成重氮化合物。刘海军（ 2000） 研究了以N，N二甲基苯胺、氨基苯甲酸为偶联的重氮试剂，利用醌式染料的合成反应测定尔吸光系数为 现性也很高，选择性好，无试剂空白。增敏光度法(潘建，2001)， 是在选择对硝基苯胺进行重氮化反应后，以 2甲基8羟基喹啉作为偶联试剂的情况下，借鉴广泛应用于金属阳离子测3中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 定的增敏作用，在形成的偶氮染料中加入阳离 子表面活性剂溴化十六烷基三甲基铵（，进行增敏测定。试验结果表明，生成的配合物在波长 590观摩尔吸光系数达 硝酸根浓度在（030）g/25符合比耳定律。刘锐等（2002）研制了一种测定微量亚硝酸盐的灵敏光度法。酸介 质中，亚硝酸盐与对氨基苯乙酮最大吸收波长为 550尔吸光系数为 030g/25硝酸盐遵守比尔定律，此方法应用于测定地表水中微量亚硝酸盐。 (2) 催化光度法 该方法的适用范围广，无毒，操作简便，易掌握，提高了测定方法的准确性、稳定性和灵敏度等，改变了现行标准方法中使用萘胺（致癌物质）作为显色剂，利用催化褪色反应原理完成亚硝酸盐的测定。在不同酸性介质中，根据亚硝酸根催化溴酸钾发生的褪色反应测定亚硝酸盐。蔺岩等（2 004）利 用硫酸介质中硝酸根催化溴酸钾氧化吖啶橙的腿色反应，建立了测定乳粉中亚硝酸盐的方法，探索了测定的最佳条件，最大吸收波长为494硝酸钠质量浓度在0g/内符合比耳定律，回收率96%102%。李贵荣（1996）研究了 在亚硝酸根催化下溴酸钾氧化酚红的褪色反应，该方法在室温下进行，操作尤为方便。高杰等（1 999）研 究了在稀硫酸介质中，痕量立了测定水及蔬菜中痕量维森等（2005） 基于亚硝酸盐催化溴酸钾氧化亮绿定范围为 0g/L,其测定结果与国标法相比差异无统计学意义（ t=。 在磷酸介质中，1998年 高艳阳等（1998） 提出了一个基于亚硝酸根对溴酸钾氧化结晶紫而使其褪色的催化作用，建立了灵敏的测定痕量亚硝酸根的新方法，测定范围为（g/方 法的测量条件为：测定波长为591酸浓度为410,温度为30，反应时间选15的直线关系较好。本法抗离子干扰能力较强，简便、快速、灵敏，可用于水样中痕量亚硝酸根的测定。徐茂田等（1999）基于磷酸介质中亚莉等（2002）利用在 磷酸介质中克永（2 001）利 用孔雀石绿与溴酸钾在磷酸介中的褪色反应速度受浓度催 化的影响，测定食品中亚硝酸盐的含量。 亚硝酸根在中性或碱性介质中可以促进溴酸钾对甲基绿（訾言勤等， 2005） 、溴甲酚紫（李吴定等，2005）等氧化，使其褪色，从而测定亚硝酸盐的含量。还4中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 有报道研究用氯酸钾或碘酸钾作为氧化剂同样 也可以测定亚硝酸盐的含量，如冯尚彩等人（1998）分析亚硝酸根催化光度法的研究情况时指出，氯酸钾作为氧化剂，测定方法选择性较好，对-、干扰能力较强，其测定检出限为从 010间 ，测定范围的从（0 2）g/桂红等（2001）根据亚硝酸盐能够加速碘酸钾氧化甲基橙退色的原理，建立了肉类制品中微量亚硝酸盐含量的比色测定，反应体系的最大吸收峰为 340 硝酸盐测定的线性范围是 0收率达 80102。 (3) 紫外光度法 此方法是在紫外区显色测定亚硝酸盐,如王明等（2000）的研究证明：在盐酸介质中，亚硝酸根与亚氨基二乙酸在溴化钾的催化下发生亚硝化反应，其亚硝化产物在近紫外区有吸收峰，最大吸收波长为 350硝酸根在（025）g/25党生等（2002）研 究了碱性品红与亚硝酸根在酸性介质中的反应，利用反应体系在265性范围（0 g/保平等（1999）利 用多元线性解析理论可分辨重叠光谱的功能。研究了用二元线性解析紫外吸收光度法同时测定-，以导数光度法能消除低频背景和高频噪音干扰及线性解析法分辨能力强的特点。他们在 条件测量192238线 性解析, 导数技术处理，同时测定试样中0的-，所测定的相对标准偏差小于或等于5% ，加标回收率在9 间。 (4) 流动 注射光度法 同其它方法相比其具有操作简单、测试准确、可以大量检测等优点，是一种值得推广的方法。国际标准（46 73规检测牛奶和奶制品中的硝酸盐和亚硝酸盐使用流体注射分析法， 0 100mg/mg/检测界限分别为 西学者（ et 003）研制了氮氧化物发生器流动注射装置，主要是利用分光光度法测定蔬菜和肉制品中的硝酸盐和亚硝酸盐含量，0mg/等（1998），003） ，e 002），002 ）对流动注射光度法都有报道。王洋等（2005）设计了一种芯片式流通池和顺序注射技术联用，基于在酸性介质中与 应生成不稳定的过氧亚硝酸，在碱性环境中猝灭为过氧亚硝酸盐迅速分解产生化学发光的原理，和常规的 顺序注射进样方式不同，将流通池作为储存管的一部分，在顺序注射进样条件下 可以迅速跟踪捕捉化学发光反应信5中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 号；采用阳离子交换树脂进行水样前处理，消除了阳离子的干扰。1010法的检测限为 6810浓度为 1101 次重复测量的相对标准偏差为 27，回收率在 9099之间，分析频率为 80h(5) 荧光光度法 林德娟等（1995）研究在酸性介质中，产物经适量 作用荧光大大增强。332/457硝酸盐（计）在 112005出线 40ng/此建立的 亚硝酸盐荧光测定法灵敏度高，选择性好，数据稳定且操作简便。 (6) 核磁共振法 （2001）利用过核磁共振（定蔬菜、水果中硝酸盐和亚硝酸盐的含量，其最低检测限取决于空气中的浓度，测定的最高浓度可至 2500g（-）和 1600g（-），但该法成本较高。 色谱法 色谱法具有操作方便、分辨率好、灵敏度高、样品前处理简单、效率高等优点，近年来运用于测定食品中硝酸盐和亚硝酸 盐含量的有关报道越来越多。英国国家标准有离子交换色谱法对肉制品硝酸盐和亚硝酸盐含量测定和H 相色谱 法已经用于水样中亚硝酸盐含量的测定（ et 997；武和平，2005），王志元等（1999 ）采用衍生化顶空气相色谱法测定食品中的亚硝酸盐，简化了前 处理步骤，既快速又准确灵敏。有报道研究用气相色谱质谱联用仪（S）测定乳粉中的亚硝酸盐（姜宏等，2001）。P. E. 984 ）利用高效液相色谱法测定肉制品中的硝酸盐和亚硝酸盐具有快速、灵敏、精确和回收率高， 此方法同样适用于蔬菜和奶酪。陈金枝等（2002）用间接紫外高效液相色谱法测定生活饮用水，纯净水及矿泉水中微量亚硝酸盐。韩会欣等（1997）建立了一种用离子对高效液相色谱法同时测定水中硝酸盐和亚硝酸盐的方法，最低检出量O 2. 001 ）建立正相离子对高效液相色谱法测定饮用水，废水和食品中亚硝酸盐的含量，而潘芸茜（2006）采用反相离子对高效液相色谱法测定水中 001 ）利用离子色谱法测定饮用水，在线分析平均每小时可分析 60 个样品，比传统的流动注射法快捷。 L. W. 004 ）研究了离子交换色谱法测定乳制品、婴儿配方奶粉和蛋白质水6中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 解产物的亚硝酸盐和硝酸盐含量，比传统的方法灵敏、抗干扰强。姚敬等（2006）建立用紫外检测离子色谱法测定酱腌菜中的亚 硝酸盐、硝酸盐的方法；王心宇等（2002）利用紫外检测离子色谱法测定肉制品、奶粉、蔬菜中的硝酸盐和亚硝酸盐。该方法测定线性范围广，操作简便，快速准确，灵敏度高。王群芳等（2002） 、王守箐（2005）、蒋蓉等（2003）建立了用离子色谱法/电导检测器测定蔬菜和水果中亚硝酸盐和硝酸盐，相对