【毕业学位论文】杆状病毒基因组扫描技术筛选病毒因子和顺式元件及其表达系统的应用博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 杆状病毒基因组扫描技术筛选病毒因子和顺式元件及其表达系统的应用 or 士研究生：陈 寅 指 导 教 师：张志芳 研究员 沈桂芳 教 授 申请学位类别： 农学博士 专 业：特种经济动物饲养 研 究 方 向： 病毒分子生物学 培 养 单 位：研究生院 蚕业研究所 提交日期 2006 年 06 月 or 006 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 杆状病毒基因组扫描技术筛选病毒因子和顺式元件及其表达系统的应用 论文作者 陈 寅 指导教师 张志芳 沈桂芳培养单位 蚕业研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 陈建国 教授 博导 北京大学 细胞生物学徐卫华 教授 博导 中山大学 遗传学 评 阅 人 周婷 研究员 硕导 中国业农科学院蜜蜂研究所 动物病理学答辩 主席 吴祥甫 研究员 博导 中科院上海生化所 病毒分子生物学 孙崇荣 教授 博导 复旦大学 生物化学 华 刚 研究教授 博导 美国佐治亚大学生科院 昆虫分子生物学 鲁兴萌 教授 博导 浙江大学 昆虫病理学时连根 教授 博导 浙江大学 分子生物学张耀洲 教授 博导 浙江理工大学 病毒分子生物学 李奕仁 研究员 博导 中国业农科学院蚕业研究所 特种经济动物饲养 答 辩 委 员 答辩时间与地址 2006 年 6 月 17 日，中国农科院蚕业研究所 记录人员 任永利 I 摘 要 利用半补齐法构建了 因组随机文库。 将 分酶切， 用 全消化质粒载体 别以 半补齐，连接、转化后得到覆盖率大于 文库。 通过与文库质粒 个共转染，鉴定了作用于早期基因 动子的反式激活因子。筛选出的质粒均含有完整的 因。 隆出 因共转染即可产生反式激活作用。为证实文库筛选的可靠性，分别克隆了其它主要早期基因并证实产物均不能对 动子产生反式激活作用。瞬时表达分析表明， 可以对其它不同来源的启动子产生强烈的反式激活。 强子的质粒不能激活另一报告质粒上的 因表达，但当细胞受到病毒感染时，便会强烈增强报告基因的表达。利用分别含有 质粒、 动子与 因的报告质粒和每个 机文库质粒的 转染家蚕细胞，结果显示杆状病毒的必需因子 强子在 胞中的反式激活作用。进一步研究还证明 子作为蛋白质桥梁能使增强子对不同来源的启动子发挥广谱性的反式作用。这种增强子的反式作用一般能使转录活性提高 40倍。 30 文序列是 强子反式激活中起作用的基本单元。 利用文库共转染筛选时发现一个较小的质粒能反式激活转录几十倍，其不包含任何病毒早期基因，但包含 因的 5侧翼非编码序列直至起始密码子上游 19 。瞬时表达证实 378 动子序列能反式增强启动子转录 40， 说明此 378 bp 动子中存在编码某个因子或存在某未知调控方式的一段序列。将此 378 bp 动子分为不同长度片段以及定点突变证明并非编码因子造成这种反式激活。推测这种转录激活现象是增强序列的反式作用，而介导这种反式作用的蛋白是来源于宿主的细胞因子。将一段 238 列分别顺式连接于报告质粒的启动子上游或报告基因的下游后发现其可以不分正反，不分上下游并能远距离的增强目的启动子转录10,000 倍以上。为了检测此非同源重复区增强子（ 不同启动子的增强活性，将其分别顺式连接至杆状病毒晚期启动子和哺乳动物病毒来源的启动子，发现 它们都能发挥很强的增强作用。另外，通过构建同时含有同源重复和非同源重复这两种类型增强子的报告质粒转染后证实两种类型增强子能够协同作用于报告基因的转录。 通过将杆状病毒转移载体中的 动子替换为 动子，利用 报告基因，再将 强子克隆于 因下游构建表达载体。共转染获得包含上述表达盒的重组病毒，通过对表达的 性分析证明，该表达盒具有良好的表达效果。 将 合酶基因 (隆入转移载体使其处于多角体启动子控制之下。共转染获得重组病毒用于感染家蚕。 析显示表达的重组蛋白约 90 产物经一步法热变性后即可直接用于高保真 。每毫升血淋巴中 合酶活性为 2 105U。 关键词 : 杆状病毒， 基因组文库， 增强子， 反式激活， 合酶 NA of , , in by of in of by of CR to by as no to to A to of of a of to in in as a to 0 to 00 of 0in a NA to No of 9 bp of TG by 78 bp of 0of by To it is an in a a 238 bp to if a in a to of 0,000 of an of MV on HE to be n of of to a NA in of to 0 in be in a CR NA up 105 U ml NA V 目 录 第一章 基因表达调控中的启动子与增强子元件 .动子元件及其研究方法 1 动子的组成元件 .1 动子相关的研究方法 3 增强子元件及其相关研究方法 5 强子的结构与作用特点 .5 强子的功能及其作用方式 7 第二章 研究目的与内容 .究目的 9 究内容 .10 补齐法构建 因组文库 .10 用 因组文库筛选反式激活因子及文库功能评价 .10 导同源重复区增强子反式激活作用的病毒因子的鉴定 .11 状病毒新型非 强子的发现及其功能研究 .11 用立即早期 动子与 强子构建的新型杆状病毒表达载体 .12 合酶基因的克隆、表达及其在高保真 的应用 . .究意义 .12 补齐法构建 因组文库 .12 用 库筛选反式激活因子 .13 毒因子 导同源重复区增强子反式激活作用 . 13 状病毒非同源重复区增强子的发现及其增强作用研究 .14 带增强子的新型杆状病毒载体表达效果研究 . .14 用家蚕表达 合酶以及表达产物在高保真 的应用 14 第三章 材料和方法 15 验材料 15 粒和菌种 . 病毒株、昆虫细胞和家蚕 .15 试剂及试剂盒 .15 它主要试剂 .16 菌培养基 .16 虫细胞培养基 .16 用溶液及缓冲液 .16 用主要仪器和设备 .17 验方法 17 V 胞的传代 17 胞的冻存 18 胞的复苏 18 能质粒由脂质体介导在昆虫细胞中的转染 18 能质粒在细胞或家蚕幼虫中转染后的病毒反式激活处理 19 胞的病毒感染 19 本病毒共转染 19 组病毒的筛选和鉴定 19 胞计数 20 法少量快速抽提质粒 .20 法大量制备质粒 .20 制性内切酶反应 .21 璃奶法纯化回收 段 21 连接 .21 粒 转化 . .21 组质粒的鉴定 .22 涵体病毒基因组 制备 .22 离病毒基因组 制备 . .22 毒滴度的测定 .23 光素酶分析 .24 度测定 .24 第四章 半补齐法构建 因组文库 25 料与方法 26 料 26 法 26 果与讨论 28 第五章 用 机文库筛选杆状病毒因子的研究 30 料与方法 31 染质粒 .31 虫细胞转染效率内参系统的建立 .31 4 孔细胞培养板转染实验实现对文库的高通量筛选 31 要早期基因的扩增与克隆 31 果 .32 染效率内参系统的建立 32 用文库筛选 动子的反式激活因子 .34 其它主要早期基因的克隆及其产物的反式激活效果 . . . . .34 其它来源启动子的反式激活作用 .35 论 36 第六章 子介导同源重复区 挥增强子反式激活作用 38 料与方法 .39 果 39 毒介导下 强子能发挥反式作用 39 机文库筛选介导 强子发挥反式作用的病毒因子 40 源重复区增强子在反式作用中的结构单元 42 论 45 第七章 杆状病毒非同源重复区增强子的发现及其功能鉴定 48 料与方法 49 库及其它质粒的构建 49 动子不同长度亚片段的扩增及克隆 .49 38 bp 动子亚片段与不同启动子报告质粒的顺式连接载体构建 49 时含有 238 段与同源重复区增强子报告质粒的构建 .50 238 件在 胞以及家蚕活体中的功能分析 .50 染、共转染 50 结 果 50 机文库 92质粒 有反式激活靶启动子转录活性 50 78 bp 动子质粒具有反式激活靶启动子的能力 .51 动子不同长度亚片段在反式激活中的作用 .51 式构象下对靶启动子的激活作用 .53 识别多种类型启动子 .54 与同源重复区增强子协同作用于靶启动子 .56 胞以及家蚕活体中的增强作用 .57 论 58 第八章 利用极早期启动子与增强子构建新型杆状病毒表达载体的研究 61 料与方法 62 料 .62 型表达载体的构建 62 组病毒的获得 62 家蚕 的表达 62 活性测定 62 准曲线制作 63 果 63 动子与 强子的转移载体构建 63 同源重组及重组病毒的筛选 63 组病毒在家蚕中的表达及活力测定 63 论 64 第九章 合酶基因的克隆、表达及其在高保真 的应用 66 料和方法 67 材料 .67 养以及基因组 取 .67 NA 因的扩增及转移载体构建 .67 组病毒的获得 68 合酶在家蚕 的表达 68 步法热变性纯化 合酶及其 泳 .68 合酶在高保真 的应用 .68 果 69 合酶基因的克隆 69 合酶基因的重组 获得 .69 组病毒在家蚕中的表达及一步法纯化 合酶 .69 泳分析 69 合酶在高保真 的应用 .70 论 71 第十章 结 论 73 补齐法构建 因组随机文库 73 机文库筛选杆状病毒因子 .73 子介导同源重复区 挥增强子反式激活作用 .74 状病毒非同源重复区增强子的发现及其功能鉴定 74 用极早期启动子与增强子构建新型杆状病毒表达载体的研究 75 合酶基因的克隆、表达及其在高保真 的应用 .考文献 76 致谢 87 作者简历 88 英文缩写 英文全称 中文名称 5 非编码序列 纹夜蛾核型多角体病毒 状病毒表达载体系统 蚕 蚕杆状病毒泛素启动子 蚕核型多角体病毒 蚕杆状病毒 动子 BV 病毒 分钟计数 牛血清 10 bp 10 状病毒解旋酶启动子 染后时间 蚕杆状病毒同源重复区 3 ie 即早期基因 光素酶基因 状病毒非同源重复区增强子 型多角体病毒 放阅读框 OV 涵体病毒 合酶链式反应 NA 斑形成单位 合酶 角体基因 肾荧光素酶 地夜蛾 中国农业科学院博士学位论文 第一章 基因表达调控中的启动子与增强子元件 1 第一章 基因表达调控中的启动子与增强子元件 真核生物的主要遗传物质集中在细胞核中，并与某些特殊的蛋白质组成核蛋白，形成一种致密的染色体结构。原核生物没有细胞核，遗传物质分散于整个细胞中，有时虽有相对集中的区域，但并无核膜包围。由于二者的细胞结构不同，它们的基因组及其基因表达调控差异明显。基因的表达调控根据其在同一事件中发生的先后次序，可分为转录水平调控（ ，转录后水平调控（ ，翻译水平调控（ ，蛋白质加工水平的调控（ 。 无论原核生物还是真核生物的基因调控主要是转录水平的，原核生物不同于真核生物的基因结构，存在转录单元，即操纵子。原核生物的转录受操纵子控制，任何开启和关闭操纵子的因素都会影响基因的转录，从而控制基因的表达。在真核生物中，虽然它们的形态和生活史完全不一样，但所编码的基因的差异却没有这么大。例如，线虫中约有 20 000 个基因 1998，虽然果蝇的结构和行为都比线虫复杂得多，但只有约 14 000 个基因 et 2000，而人约有 30 000 个基因 et 2001。而且，高等动物多出来的基因大部分是通过在基因组内复制原有基因，扩增家族成员而获得的，新创造出来的基因很少。说明生物复杂性的决定性因素不是基因的数目，现在认为有两种主要方式提高高等生物的复杂程度：一是单个基因有许多不同的剪切形式，可以在不同时期起着不同的功能；二是高等动物的基因表达调控更加精细复杂，决定了种类繁多的细胞和复杂器官的形成 2003。在特定的时间，只有 15%左右的基因能在特定的细胞中表达。根据机体的不同发育阶段，不同的组织及不同的功能状态，选择性、程序性地使特定数量的特定基因被激活 992。基因的转录受特定的顺式作用元件（ 影响，如启动子，增强子等功能元件，同时还受到反式作用因子（ 的调控， 如蛋白质分子、 激素蛋白质的复合物等一些具有可扩散特性的物质。基因表达调控的信息是如何编码的，是一个基本的生物学问题。随着大规模基因组研究的开展，人们希望通过生物信息学的方法确定在基因组中的哪些区域包含着以特定次序，特定间隔排列的调控信息。本文着重就真核生物基因表达调控中的两种重要顺式作用元件，即启动子与增强子的作用方式、特点以及对于这两类元件的研究方法作一概述。 动子元件及其研究方法 核生物中蛋白质编码基因的转录是由 合酶来执行的。 这种转录的精确起始需要在基因的核心启动子形成一个巨大的多蛋白复合体。 特定的转录因子识别核心启动子中特定的元件，中国农业科学院博士学位论文 第一章 基因表达调控中的启动子与增强子元件 2 将通用转录因子和 合酶募集到核心启动子区，形成前起始复合体，随后由 合酶开始执行基因的转录。典型的核心启动子一般位于转录起始位点附近，长约 100 右，通过它们驱动基因的基础转录并对上下游调节蛋白的刺激做出响应。其发挥作用是有方向性的，且与其所在位置紧密相关。截至目前，至少发现了 4 类由 合酶识别的核心启动子（ or 件 2001。核心启动子的碱基序列、位置与功能上具有高度的保守性。单一的核心启动子元件能使基因在一个较为恒定的低水平上表达。最早被认识到的核心启动子元件是位于转录起始点上游 20一段富含 基对的 ， （又称） 。 的功能受到与转录起始位点相对应的方向、序列及位置的限制，与 合，后者充当其它转录因子和 合酶的互作点。因而 的主要功能是参与转录的起始，从而影响基因的转录水平；第二类核心启动子元件位于转录起始点下游 28，称为下游启动子元件 (核心序列为 (A/G)G(A/T)证明 过 件协同发挥转录调控作用 2000；第三类上游核心启动子元件称为 共同的保守序列为 (C/C)(G/C)(G/A)类元件从上游紧挨着 ，被 别，在真核细胞中调节前起始复合物的装配 et 2000。 在这 4 类元件中， 2 类不依赖 对启动子数据库的分析显示， 果蝇基因中有 57%的核心启动子是不含 人基因组中没有做过类似的调查，但人类的管家基因、癌基因、生长因子和转录因子基因通常不含 。这暗示 件在这些基因的转录起始中可能扮演着至关重要的角色。 图 核生物启动子的基本调节模式和精细调节模式的比较 of or of a) 在酵母或一些后生动物简单的启动子中，只包含最基本的转录单元：一个募集转录起始复合物的核心启动子序列（通常含有 、一个上游激活序列（ 一个上游的沉默序列（ 。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 基因表达调控中的启动子与增强子元件 3 (b) 后生动物的精细而复杂的调节模式。核心启动子序列可能是 录起始位点（ 下游单元盒（ ，在近距离启动子上结合与转录激活或介导增强子相关的转录因子。在启动子上游、下游 10围内或内含子中会出现若干个增强子（ ，而这些增强子有时会被可能出现的沉默子（ 绝缘子（ 隔和调节。 （引自 2003） 。 启动子相关的研究方法 若需对上述启动子元件进行鉴定，其基本程序是应用一系列的突变技术对目的基因启动子序列作诱变处理，然后构建启动子 过对一个易于检测的报告基因的产物分析，可测定在启动子上特异性突变对目的基因转录和表达的影响，最终揭示复杂启动子的结构和特征，从而鉴定出参与转录调节的相关启动子元件。 突变分析是鉴定顺式作用元件的最可靠的方法， 绝大多数突变分析包括缺失突变和取代突变，此方法能分析各种类型的调控区域中的顺式作用元件。虽然启动子元件的鉴定也可以通过研究顺式作用元件与转录因子的相互作用来完成，完整的突变分析仍是严格鉴定基因调控区重要顺式作用元件的最佳方法。 首先通过缺失突变分析确定功能启动子的调控区边界， 然后通过一系列的 6取代突变来扫描此调控区的重要顺式作用元件， 最后对每个元件进行更为精确的 3 代突变，以此来确定每个元件的边界和分析每个元件是否代表某一结合蛋白的结合位点或多种蛋白的共同作用位点。 突变分析也有其一定的局限性，如需要大量的时间和实验工作、所鉴定的调控元件只包括所分析的调控区发挥功能所必需的元件，而且多种 件存在于调控区而不利于调控区边界和重要 件的确定。相比而言，体外结合分析与数据库分析具有快速、相对简单，特别是对于分析已知的转录因子或顺式作用元件具有重要的作用。 通过对某个基因转录活性的调节作用来进行转录活性的分析是研究启动子的最常用的手段。检测转录活性最常用的方法是把启动子连接到一个报告基因的上游，通过检测报告基因的活性来反映结合在启动子上的转录因子的调节功能。 报告基因可以是一个普通的基因， 通过 量；也可以是一些灵敏度高、活性易于检测的酶，如荧光素酶（ 、氯霉素乙酰转移酶（ ，通过检测酶活性来反映转录活性。这些启动子 行细胞转染，或通过转基因的方法整合到基因组中，在活体水平上检测某个转录因子的结合位点对启动子转录活性的影响。 在精确研究启动子的作用途径时，启动子与 合蛋白的互作是不可缺少的。基因转录实际上是 合酶转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。 启动子 合蛋白作为转录调控因子通过与启动子 合以调节基因转录。 犹如抗原 白质与 结合也是特