【毕业学位论文】猪瘟和猪水泡病基因标记疫苗的研究博士论文

密级: 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 猪瘟和猪水泡病基因标记疫苗的研究 of 交日期 2005 年 12 月 博士研究生：冯 霞 指 导 教 师：谢庆阁 研究员 刘湘涛 研究员 申请学位类别 ：农学博士 专 业：预防兽医学 研 究 方 向：动物病毒基因工程 培 养 单 位：兰州兽医研究所 of : 005 评阅人和答辩委员会 论文评阅人 ：杨汉春 教 授 中国农业大学 胡永浩 教 授 甘肃农业大学动物医学院 邱昌庆 研究员 兰州兽医研究所 答辩委员会主席：余四九 教 授 甘肃农业大学动物医学院 答辩委员会成员：余四九 教 授 甘肃农业大学动物医学院 吴 润 教 授 甘肃农业大学动物医学院 胡永浩 教 授 甘肃农业大学动物医学院 张永光 研究员 兰州兽医研究所 殷 宏 研究员 兰州兽医研究所 罗建勋 研究员 兰州兽医研究所 刘在新 研究员 兰州兽医研究所 答辩时间：2005 年 12 月 23 日 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作过的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签字： 时间： 年 月 日 略词 英文名称 中文名称 苄青霉素抗性 原递呈细胞 边界病病毒 仓鼠肾细胞系 牛病毒性腹泻病毒 萨奇病毒 腺病毒受体 of 化群 E 细胞病毒早期 瘟 SF 猪瘟病毒复制子颗粒 瘟病毒 胞毒性 T 淋巴细胞 萨奇病毒 变加速因子 突状细胞 高辛 s 低必需培养基二胺四乙酸 链延伸因子 1 联免疫吸附试验 心肌炎病毒 口蹄疫 蹄疫病毒 多糖 细胞 型肝炎病毒 型肝炎病毒表面抗原 类免疫缺陷病毒 酸乙酰肝素 休克蛋白 纯疱疹病毒 辣根过氧化物酶 扰素 （或 M） 细胞介素 部核糖体进入位点 疫刺激序列 B 培养基 数致死量 克隆抗体 抗单克隆抗体 要组织相容性复合体 饰活疫苗 肽疫苗 使 -4,52,5甲基偶氮唑盐 密度 界动物卫生组织 放阅读框 酸缓冲盐水 合酶链式反应 肠道病毒 斑形成单位 物血凝素 殖与呼吸综合征病毒 狂犬病病毒 髓灰质炎病毒 肽疫苗 组腺病毒 组猪腺病毒 组痘病毒 分钟转速 转录 同源重复序列 二烷基磺酸钠 门利克森林病毒 辛德比斯 0 猿猴病毒 40 水泡病 水泡病病毒 细胞受体 助性 T 细胞 瘤坏死因子 翻译区 苗病毒 毒样颗粒 毒中和试验 毒基因组连接蛋白 疱性口炎病毒 光霉素抗性 要 猪瘟和猪水泡病被世界动物卫生组织（ 入 A 类传染病名录，世界各国对这两种疫病均采取了严加防制及消灭措施，二者也是国际贸易中必查必检的对象。疫苗接种是预防和控制动物疫病的主要手段。由于传统疫苗在生产中的生物安全隐患和感染与免疫动物难以鉴别等缺陷，利用现代分子生物学技术和免疫学理论，研制新型安全、多联、可鉴别疫苗已成必然之势。基因疫苗以其自身的诸多优点和巨大的应用潜能已成为当今的研究热点之一。本研究通过 式 亚克隆技术构建了猪水泡病基因疫苗、猪水泡病和猪瘟二联基因疫苗和几种猪瘟基因疫苗，研究其免疫效果，为最终研制成功猪瘟和猪水泡病基因疫苗作技术探索。 1) 构建了几种猪瘟基因疫苗：包括 因单表达重组质粒 因双抗原表达质粒 因与报告基因 表达质粒 因共表达质粒 及 因与猪 因共表达质粒以上真核表达质粒分别转染 胞，用原位染色、酶联免疫吸附试验（ 术证实它们均可表达外源基因。 2） 用这几种猪瘟基因疫苗免疫兔，以阻断 监测试验兔抗体水平和淋巴细胞增殖情况，并进行攻毒保护试验。结果，单表达质粒 疫组中有 3/4 兔产生 毒后， 4/4 完全保护。双抗原表达质粒 疫组有 1/4 兔产生抗体，攻毒后， 1/4 完全保护， 1/4 部分保护， 2/4 不保护。 未检测到猪瘟抗体（ 4/4） ，攻毒后， 1/4 部分保护， 3/4 不保护。 3 只）也没出现猪瘟抗体，攻毒后， 3/3 部分保护。而空载体 4/4 血清阴性，攻毒后，全部发病。与对照组相比，各免疫组的淋巴细胞均有一定程度的增殖。 3）构建了猪水泡病和猪瘟二联基因疫苗 2/ 它转染 胞，以间接免疫荧光染色和 别检测到猪水泡病和猪瘟抗原的表达。将其免疫兔，可检测到免疫组兔 T 淋巴细胞增殖明显； 但用阻断 检测到血清 异性抗体， 用猪瘟活疫苗 （）攻击， 实验兔有 1/4 完全保护。 用乳鼠中和试验检测， 发现所有兔血清 和抗体均低于 1:4。 4）构建了猪水泡病基因疫苗 1，将其转染的 胞经荧光染色，可见许多特异性荧光细胞。用其单独（ B 组）免疫或与 同（ C 组）免疫猪三次，检测免疫前、后猪血清中 异性抗体的变化，发现免疫后 B 组和 C 组各有两只猪产生低水平的抗体，并在攻毒后迅速升高；并对免疫前和攻毒前的猪血清用乳鼠中和试验检测 异性抗体，结果只有 1 与 同免疫组中有两只猪产生低水平的中和抗体（ 1:4） ，其余猪的中和抗体均小于 1:4。第三次免疫 3 月后，用猪水泡病香港乳鼠组织毒 52叉和 3两个滴度（ 104.1 105.1 击，结果 1 单独免疫组（ B 组）有 1/4 获得完全保护（为 104/0.1 击） ， 1 与 同免疫组（ 有 1/4 获得部分保护（为 105/0.1 击） ， A 和 D 两个对照组全部发病。 关键词： 2 基因， 1 基因，基因疫苗，标记疫苗，细胞因子，报告基因，兔，猪 of in by is to a of is of be in on an of SF In by of VD or/SF in of to to of 1) of a 2 2 a 2 a of a 2 a of a 2 a of 8 2 in a of in by a of 8 in 2) SF in or 3 4 SF ). , Of 1/4 of 2 , of of or , , 3/3) 2 or 4/4 2 ) 2/ 1 of 2 of CR To in by 2/in by by a 2 in a 2/ t of 2, ( ). of of :4 by 4) 1 VD To in in by by a to in by 1 or 13 by in of 2/4) 1 or 1 of 2/4) 1:4) in 1 in :4 by of 04.1 mL K) on 3 at of 2 05.1 mL of of in 1 04.1 mL of in 1 05.1 mL 3 or 2 5/5 VD In of of NA to SF 2 1 录 第一章 序 言 .究背景及目的、意义 . 猪瘟、猪瘟病毒和猪瘟弱毒疫苗 . 猪水泡病和猪水泡病病毒 . 基因标记疫苗 . 本研究的目的及意义 .内外研究现状 . 猪瘟疫苗研究进展 . 猪水泡病疫苗研究概况 .究内容与方法 .二章 猪瘟基因标记疫苗的构建及体外表达 .材料和方法 . 菌种、载体和主要试剂 . 主要仪器 . 细胞和种毒 . 引物的设计与合成 . 目的片段的获得 . 重组质粒的构建、克隆及鉴定 . 转染质粒的提取 . 转染 . 各基因体外表达的检测 . 果 . 目的片段 .达质粒的鉴定 . 转染质粒浓度 . 各基因的体外表达 .讨 论 .三章 猪瘟基因标记疫苗对兔的免疫保护试验 .料与方法 . 质粒、疫苗与实验动物 . 主要试剂 . 免疫用质粒的制备 . 各猪瘟基因疫苗对家兔的免疫 . 阻断. . 病毒攻击保护试验 . 果 . 兔血清. . 攻毒试验 .讨 论 .四章 猪瘟与猪水泡病二联基因疫苗研究 .料和方法 . 菌种、载体和主要试剂 . 细胞、种毒、质粒、疫苗和实验动物 . 猪瘟病毒因与猪水泡病病毒基因双表达质粒的构建 . 转染质粒的提取、转染和体外表达 . 免疫用质粒的制备 . 双表达基因