【毕业学位论文】猪繁殖与呼吸综合症病毒非结构蛋NSP4结构与功能的研究博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 猪繁殖与呼吸综合症病毒非结构蛋白构与功能的研究 博士研究生：胡 涛 指 导 教 师：才 学 鹏 研究员 申请学位类别：农学博士 专 业：预防兽医学 研 究 方 向：病原分子生物学 培 养 单 位：研究生院 兰州兽医研究所 提交日期 2006 年 06 月 u 2006 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 猪繁殖与呼吸综合症病毒非结构蛋白 构与功能的研究 论文作者 胡涛 指导教师 才学鹏 培养单位 兰州兽医研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 评 阅 人 答辩 主席 吴润 教授 博导 甘肃农业大学 预防兽医学 黄有德 教授 博导 甘肃农业大学 预防兽医学 胡永浩 教授 博导 甘肃农业大学 预防兽医学 殷宏 研究员 博导 兰州兽医研究所 预防兽医学 邱昌庆 研究员 博导 兰州兽医研究所 预防兽医学 刘湘涛 研究员 博导 兰州兽医研究所 预防兽医学 刘在新 研究员 博导 兰州兽医研究所 预防兽医学 答 辩 委 员 答辩时间与地址 2006 年 06 月 16 日于兰州兽医研究所 记录人员 鲁炳义 摘 要 猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合症病毒( 起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。毒,其基因组大小为 15右。因组包含 9 个开放开放阅读框，分别编码病毒的复制酶( 1b)，4 个膜相关的糖蛋白(a 至 5)，2 个非糖基化的膜蛋白(和 N 蛋白(复制酶被至少 3 个由病毒自身编码的蛋白酶酶解。通过氨基酸序列的比对分析，非结构蛋白 C 样丝氨酸蛋白酶活性，并使用 为催化三联体。 此外， 推测 底物结合区包括 氨基酸残基。这两个氨基酸残基在 3C 样半胱氨酸蛋白酶中也是保守的，并负责酶对底物切点(特异性。 为了研究 生化特性和结构特征，在大肠杆菌表达系统中表达了野生型 变体 变体 变体 变体及 末端截短型经镍离子亲和层析柱(纯化获得了高纯度的重组表达蛋白。对纯化的重组表达蛋白进行 析，结果表明这些重组蛋白在大肠杆菌系统中获得正确的表达。利用合成的多肽底物 S（反相高效液相色谱技术，建立了定性检测活性的方法。利用该方法我们检测了 生型、突变型、末端截短型等重组表达蛋白的酶活性。野生型 在体外酶解多肽底物 S，酶切产物经 谱测定其分子量，结果表明底物多肽 S 中的 键被切断，从而得到了预期的产物。说明野生型 C 样丝氨酸蛋白酶活性。而4个 变体和 2 个末端截短型 不表现出 3C 样丝氨酸蛋白酶活性，说明 3 等氨基酸残基是 C 样丝氨酸蛋白酶活性所必须的。从而证实了关于 成 C 样丝氨酸蛋白酶催化三联体以及 物结合位点的推测。同样，N 末端和 C 末端氨基酸残基也都是 分子筛层析和 体外的溶液中存在着大量的聚体，即使在浓度（低的条件下也有大量的二聚体生成，且有少量的三聚体。随着蛋白浓度的升高（2mg/聚体显著增多。推测二聚体是 C 样丝氨酸蛋白酶的主要活性形式。体外主要以三聚体形式存在，即使在低浓度（件下也是如此。体外主要以单体形式存在，即使在高浓度（2mg/件下也是如此。这个结果表明 C 末端对于 体的二聚化是必须的，它在酶单体二聚化过程中起着关键作用。猜测 聚体起稳定作用，防止 使用圆二色光谱仪对 生型、突变型、末端截短型等重组表达蛋白的二级结构进行研究。结果表明 折叠为主要的结构特征，点突变 64V、133L 都对构有不同程度的影响。N 末端或 C 末端截短对 二级结构构成产生了显著的影响，使这表明持正常构象所必须的。 I 以马动脉炎病毒 3D 结构为模板，同源模建了 3D 模型。并对该 3D 模型进行了结构合理性评估。 3D 模型由三个结构域组成，具有典型的双折叠桶状结构。分析了其活性中心和底物结合位点，进一步证实了 成催化三联体以及 物结合位点的结论。最后，使用分子对接技术，将底物多肽（接到了 活性中心。的氨基酸残基 ）处于 物分子（合在活性中心负电荷的区域。 通过以上研究，我们获得了对 C 样丝氨酸蛋白酶生化特性和结构特征的了解，增进了我们对 原分子生物学的认识。 关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒，非结构蛋白 构，功能 is by in in of in is a a NA of 5 b), a ), ( an is by at (is a 3to to in On hr is in (In to to 133L), a a to of to （ . of S. at lu ly by 4 It a in by a in at at 2mg/ to be in at as in mg/is II or of D. on to of a of D to D a is is at in of by E） at 1 of in of It is , V 目 录 第一章 绪论 .繁殖与呼吸综合症病原学研究进展. . . 病毒起源之说 . 病毒的分类地位 . 病毒的形态与发生 . 病毒的培养与细胞受体 . 致病机理 . . 因组 . 猪体内的分布 .状病毒 3C 样蛋白酶研究进展. 命名 . 同源性分析 . 活性中心 . 底物酶切位点的特异性 . 巢状病毒主要蛋白酶的 3D 结构 .究目的与意义. .二章 结构蛋白 其突变体的克隆与表达 .言. .料与试剂. . 病毒. . 载体、引物与菌株 . 工具酶与试剂 . 主要溶液与培养基配制 .法. . 病毒 . 病毒 提取 . . 断的回收 . 限制性酶切消化 . 断和载体的连接 . 冷氯化钙法制备新鲜感受态细胞 . 高效感受态细胞制备方法 . 常规转化法 . 落 定 .1 质粒 小量制备 .2 质粒的酶切鉴定 .3 基因测序 .4 细菌的培养及菌种保存 .5 重叠延伸法定点诱变 因 .6 重组蛋白的诱导表达 .7 菌体的收获和破碎 .8 重组表达蛋白的纯化 .9 重组表达蛋白的 析 .果. . 因的 增 . 重叠延伸法定点诱变 因 . 菌落 定 . 重组表达质粒的酶切鉴定 . 重组表达质粒的 列测定 . 诱导表达和纯化 . 重组表达蛋白的 定 .论. .三章 结构蛋白 化特性的研究 .言. .料与方法. . 试剂 . 储备液、实验溶液 . 仪器设备 . 蛋白质浓度的测定 . 底物多肽的酶切 . 酶切产物的 析 . 酶切产物的质谱分析 . 重组表达蛋白的的分子筛层析分析 .果. . 底物多肽酶切产物的 析 . 质谱分析 . 重组表达蛋白的的分子筛层析分析 .论. .四章 结构蛋白 构的研究 .I 言. .料与方法. . 圆二色光谱的测定 . 基酸序列 . 维结构的同源模建 . D 模型结构合理性的评估 . D 模型结构相似性搜索 . D 模型与马动脉炎病毒 D 结构的叠合 . D 模型与底物多肽的分子对接 .果. . 二色光谱的测定 . 基酸序列的 . 3D 模型 . D 模型结构合理性的评估 . D 模型结构相似性搜索 . D 模型与 D 结构的叠合 . D 模型与底物多肽的分子对接 .论. .五章 研究总结 .考文献 .谢 .文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 3C 样蛋白酶 3C 样丝氨酸蛋白酶 aa 基酸 bp 基对 血清白蛋白 二色 炭酸二乙酯 硫苏糖醇 动脉炎病毒 二胺四乙酸 压液相色谱 际病毒分类委员会 丙基DV 乳酸脱氢酶增高症病毒 非结构蛋白 放阅读框架 泡巨噬细胞 合酶链式反应 白质数据库 繁殖与呼吸综合症病毒 二烷基璜酸钠 氟乙酸 国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 第一章 绪 论 繁殖与呼吸综合症病原学研究进展 猪繁殖与呼吸综合症( 2 0世纪80 年代末出现的一种新病，其症状主要表现为怀孕母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎及仔猪感染后的成活率下降,成年猪的呼吸道症状(et 1992； et 1999；et 1998)。同时还会导致免疫抑制而继发多种其它疾病。目前，该病在全世界几乎所有养猪地区都有流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损失，引起了国内外学者的广泛关注。 1987 年该病首次在美国的北卡罗纳、衣阿华等州暴发，并在全美迅速蔓延(989)。最初,人们不能确定其病因,故此病一度被称为“神秘病”(也有人根据其临床特征将其称为“猪不孕流产综合症”( “猪不孕与呼吸道综合症”(及“蓝耳病”(。 1991 年荷兰科学家 士用猪肺巨嗜细胞(离到致病因子莱立斯塔病毒( (et 1991), 后，和报道了他们分离的病毒，即 洲型代表株 ，通过对该病毒的形态、结构、基因组组成和免疫学特性的研究,确定其为一种新发现的病毒(et 1992；et 1992)。随后,加拿大、日本、德国、荷兰等一些国家也先后报道了该病的发生。1991年欧洲爆发了毁灭性流行,造成了近百万头猪死亡。1992 年在美国的米尼苏达州圣堡罗举行的关于本病的专题讨论会上，正式命名为“猪繁殖与呼吸综合征( ，并得到国际兽疫组织（承认，将其定为 B 类传染病。同年，欧共体将该病统一命名为“猪繁殖与呼吸综合症( 。 我国 1991 年在台湾地区发生此病，国内陈博文等于 1996 年从国外进口猪中检出 清抗体阳性（陈博文等，1996） 。郭宝清等于同年在建立猪生殖一呼吸综合症病毒(性杭体间接免疫荧光检测技术和病毒分离方法的基础上，对国内有本病症状的猪群作了血清学调查和病原分离，先后在 10 个地区的 10 个猪场采集了 151 份血清样品，其中 4 个猪场 99 份血清样品中检出 8份，阳性率为 58/99)，在 58份阳性血清中有 23 个样品来自 测结果 100%阳性(郭宝清等，1996)。采用猪肺巨噬细胞和 胞培养，对国内疑似暴发流行 某地猪场进行了病毒分离，从流产死胎中分离到 4 株。这 4 株毒均可在猪肺巨噬细胞和 胞上生长，并产生特征性化。用 国分离毒株 血清分别对 4 株 株感染细胞进行间接免疫荧光试验，结果表明这 4 个 株近似于美洲型 宝清等，1996)。从血清学和病原学角度，首次证实在我国的猪群中存在 个阳性猪场分布于东北、华北、华中和华南 4 个大区。表明本病在我国广泛存在。 1 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 毒起源之说 起源仍很神秘，在北美和欧洲，该病是由 两种基因型引起，它们的基因组大约有 40%的差异（见图 1。欧洲和北美 别以 简称 、称代表株。为解释两种不同的 因型的起源和进化，G 于 2003 年提出了由鼠乳酸脱氢酶增高症病毒(异 进化而来，且以野猪为中介宿主的假说（G，2003） 。 图 1与 氨基酸序列比较的示意图(et 1999) of V 酸、 氨基酸序列比对的结果表明所有的 离株与 切相关。 在比对了 放阅读框5（酸序列而绘制的种系发生树上，分枝位于 、连线上可看出 两者有近似相同程度的相关性（见图1。同时，也可通过在所有病毒蛋白中找到一些具有同源性的氨基酸来证实这种关系（见图1。传学的稳定性及其与 2 个 因型之间的关系，表明了 有可能起源自图 1洲株、欧洲株与 进化树（003） 32 5 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 图 1、与 蛋白氨基酸序列比对（2003） of LV G 推测过伤口感染了中欧的野猪后产生的变异病毒，这些野猪曾作为狩猎使用被引进美国，被引进的野猪就作为中间宿主将病毒传播至北卡罗来纳州，感染的时间大约发生在 1912 年。这些病毒在这两大洲内独立变异和进化，大约经过七十年左右的时间，通过家猪和野猪的接触，病毒进入家猪群中，形成了后来的两大独立的 型（即通常所说的 2 种基因型） ：欧洲型（以 称 美洲型（以 代表，简称。 欧洲和北美在1991et et et et 。回顾性检测也同时发现美国的爱荷华州在 1985年，明尼苏达州在 1986年，东德在 1988的猪血清中发现了 抗体，而在 1985 年之前爱荷华州以及德国的家猪血清内却并未检测到相应的抗体。 毒的分类地位 在 1996 年第 10 届国际病毒学大会上，国际病毒分类委员会(过了两项提议： 1， 将马动脉炎病毒(鼠乳酸脱氢酶增高症病毒(e 、猪繁殖与呼吸综合征病毒( 猴出血热病毒(于新成立的动脉炎病毒科(2，新成立的 动脉炎病毒科和冠状病毒科(属于巢状病毒目( 这标志着动脉炎病