【毕业学位论文】鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作 系统的建立及基因功能研究 of 交日期 2007 年 6 月 博士研究生: 祁小乐 指导教师: 王笑梅 研究员 申请学位类别 : 农学博士 专 业: 预防兽医学 研究方向: 分子病毒学和免疫学 培养单位: 研究生院 哈尔滨兽医研究所 he of 2007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究 论文作者 祁小乐 指导教师 王笑梅 培养单位 哈尔滨兽医研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 刘湘涛 研究员 博士生导师中国农业科学院 兰州兽医研究所 预防兽医学张永光 研究员 博士生导师中国农业科学院 兰州兽医研究所 预防兽医学评 阅 人 刘长明 研究员 博士生导师中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学答辩 主席 刘文周 教授 博士生导师 东北农业大学 预防兽医学华育平 教授 博士生导师 东北林业大学 野生动物医学 师东方 教授 博士生导师 东北农业大学 预防兽医学童光志 研究员 博士生导师中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学于力 研究员 博士生导师中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学刘胜旺 研究员 博士生导师中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学答 辩 委 员 曲连东 研究员 博士生导师中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学答辩时间与地址 2007 年 6 月 16 日下午于哈尔滨兽医研究所学术报告厅 记录人员 高玉龙 要 鸡传染性法氏囊病（ 由鸡传染性法氏囊病病毒（ 起的一种主要危害 3龄雏鸡的急性、高度接触性传染病。该病于 1957 年首发于美国 区， 50 年来，一直威胁着养禽业的发展。免疫抑制、抗原变异，特别是超强毒株（ 出现，使得该病的防控形势更加严峻。国际兽疫局（ 为 “影响社会经济的重要疾病 ”。关于 变异以及毒力和细胞嗜性的分子基础，一直是科研工作者研究的重点之一。 本课题组的前期研究将超强毒 （ 胚传 5 代、 传 20 代驯化致弱为减毒株 致鸡死亡率高达 60%以上且不适应 胞培养， 对鸡无明显毒力且能在 增殖，传代致弱过程中的 毒对鸡的毒力显著降低而且适应 胞培养。 本研究建立了 因组长距离高保真 法（ ，利用此方法克隆了 t 的全基因组以及超强毒 代致弱过程中的 毒的 对其进行了测序。 序列分析发现，与 比较， 毒 2 个氨基酸突变（ ， 此基础上又有 10 个氨基酸突变。另外， 与 在 各有 4 个、 6 个氨基酸差异。本研究的目的是构建高效 向遗传操作系统，研究 基因的序列差异与胞嗜性、复制和毒力的关系。 目前用于 究的体外转录、基于 合酶的体内转录、 合酶体内转录等反向遗传操作系统在病毒拯救效率和操作简便性等方面仍然存在着一些问题。本研究以全新的思路成功构建了 I 介导的 效反向遗传操作系统。分别在 基因组两端引入了锤头状核酶结构（ 丁肝病毒核酶结构（ 并将其克隆在真核表达载体 强子和 肌动蛋白启动子下游， 构建 染性克隆 经 化后，在 000（ 介导下，直接转染 胞， 72h 后取上清继续在 传代。 接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的 存在分子标签。拯救毒在 能产生特有的砂砾状 与亲本毒 一致的复制动力学曲线。该系统高效、简便、稳定，具有良好的细胞普适性，能在 6、 12 等多种细胞上高效拯救出病毒。 效反向遗传操作系统的建立为深入研究 基因功能奠定了基础，也为其它双 毒的反向遗传操作提供借鉴。 采用融合 方法对 用所建立的反向遗传操作系统，拯救出了三个 过复制动力学试验和 明： 53和 284位氨基酸决定 284且具有明显的减毒作用； 222P、七个位点也与 另外，将 用上述反向遗传操作系统，拯救出三个嵌合病毒 过病毒复制动力学试验和对 明 中 本研究用全新的思路成功构建了 I 介导的 向遗传操作系统，并对功能作了研究，对全面了解 结构与功能，明确 异的分子基础，揭示 病与免疫的分子机制，探索 子致弱方法，研发适合于流行毒株的新型疫苗具有重要意义。 关键词： 鸡传染性法氏囊病病毒， ，反向遗传操作， 因功能 by is of an -6 BD 957. 0 of a at 3of . of In of x t in 5 in 20 x of 0% EF 9) EF In t P2 9 x, 284T) P2 9, P2 t. P3 P4 x t, of is to an to of on To of in by 7 NA I, to in of In it an NA an of MV of FI 000 ( 72h of EF of PE EF as its t. NA in is to at 6, 12 be to of P2 x 9 t P2 t 9 By in of of 253H 284T P2 of EF 22, 242, 256, 279, 294, 299, 330 P2 t x, By of P3 EF of 981L t t EF no It to an NA an is to to to to to is to t 录 第一章 绪论 . 1 传染性法氏囊病病毒（ 究进展 . 1 . 2 . 2 . 3 物 . 7 外转录拯救系统 . 7 于 . 8 拯救系统 . 9 救系统 . 10 传染性法氏囊病病毒（ 拯救系统 . 10 传染性法氏囊病病毒（ 反向遗传操作研究 . 11 于 . 11 于 . 12 记疫苗研究 . 13 非编码区功能的研究 . 14 题与展望 . 15 研究的目的和意义 . 16 第二章 鸡传染性法氏囊病病毒 . 17 料与方法 . 17 毒、细胞、质粒和菌种 . 17 具酶与主要试剂 . 17 要仪器 . 18 物设计与合成 . 18 . 18 . 19 . 19 9 代毒 因的扩增与克隆 . 19 9 代毒 列分析 . 20 果 . 20 . 20 9 代毒 因的克隆 . 20 因组遗传演化分析 . 21 因组序列分析 . 22 论 . 23 鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立 . 24 料与方法 . 25 毒、细胞与单克隆抗体 . 25 粒和菌种 . 25 具酶与主要试剂 . 25 要仪器 . 25 物设计与合成 . 25 分子标签引入 . 26 核酶结构引入 . 27 基因组真核表达载体的构建 . 28 毒拯救 . 29 救病毒 . 30 救病毒间接免疫荧光鉴定 . 30 救病毒电镜检查 . 30 救毒与亲本毒复制动力学比较 . 30 . 31 果 . 31 . 31 酶结构的引入 . 32 基因组真核表达载体的构建 . 32 毒的拯救 . 32 救病毒 . 33 救病毒间接免疫荧光鉴定 . 33 救病毒电镜检查 . 35 救毒与亲本毒复制动力学比较 . 35 . 35 论 . 36 . 36 突变方法与分子标签 . 37 酶与基因组的完整性 . 37 因组的保真性与病毒的拯救 . 37 . 38 响病毒拯救效率的其他因素 . 38 定病毒拯救成功的指标 . 39 第四章 鸡传染性法氏囊病病毒 因功能的研究 . 40 料与方法 . 41 毒、细胞和质粒 . 41 . 41 具酶与主要试剂 . 41 要仪器 . 41 物设计与合成 . 41 换 . 42 9 代毒 换 . 44 9 代毒 换 . 45 . 45 因替换的嵌合病毒拯救 . 45 合病毒的鉴定 . 46 合病毒复制动力学试验 . 46 合病毒毒力试验 . 46 验鸡法氏囊病毒分离 . 46 验鸡法氏囊 . 46 验鸡血清抗体效价的测定 . 47 果 . 47 换 节段真