【毕业学位论文】桑叶次生代谢产物研究博士论文

论文编号： 中国农业科学院 学位论文 桑叶次生代谢产物研究 士 研 究 生：刘 利 指 导 教 师：潘一乐 叶文才 申请学位类别：农学博士 专 业 ：特种经济动物饲养 研 究 方 向：桑树种质资源利用 培 养 单 位：蚕业所 提交日期 2005 年 6 月 i 2005 论文评阅人与答辩委员会成员名单 论 文 评 阅 人：赵杰文 教 授 江苏大学 吴大洋 教 授 西南农业大学 李奕仁 研究员 中国农业科学院蚕业研究所 答辩委员会主席：黄自然 教 授 华南农业大学 答辩委员会成员：楼程富 教 授 浙江大学 吴大洋 教 授 西南农业大学 蔡伟明 研究员 中国科学院上海植生所 秦 利 教 授 沈阳农业大学 郭锡杰 研究员 中国农业科学院蚕业研究所 黄君霆 研究员 中国农业科学院蚕业研究所 论文答辩日期：2005年6月25日 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 2005 年 6 月 18 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 时间： 2005 年 6 月 18 日 导师签名： 时间： 2005 年 6 月 18 日 摘 要 桑叶不仅是家蚕的唯一饲料，而且也是重要的传统中药，在我国及其它一些国家被广为应用。桑叶具有降糖、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎等多种药理活性。近年来，对桑叶化学成分进行了不少研究，从中提取分离到了多种黄酮类、生物碱类及苯丙素类化合物。 我国是世界上最大的蚕桑生产国。我国有 15 个桑种 4 个变种，桑树在全国各地均有分布， 2004年全国桑园面积约 75 万公顷，年产桑叶约 1 500 万吨。为推动桑叶的综合利用及其产业化进程，对桑叶次生代谢产物进行了较为系统的研究。 通过溶剂提取，色谱分离，波谱鉴定，从桑叶中共分离得到 21 个化合物，鉴定了其中 16 个化合物的结构，分别是：山柰酚槲皮素 5，7 ， 2， 4, 7, 2, 4 18）、 苯甲酸（ 7 尿嘧啶（ 15）、丁二酸（ 13）、山柰酚-(6-(6 、胸腺嘧啶（ 7氧基香豆素 、山柰酚 5， 7, 7 3， 4, 4 其中化合物 、3 、 11、 19 为黄酮类化合物，14、23 为香豆素类化合物，18)、 6 为甾体类化合物，10( 13)、 24为有机酸类化合物， 5)、 12 为含氮化合物。以上化合物中， 9(15)、 11、 12、 16、19、24 为首次从桑属植物中分离得到；新天然产物；新化合物。 通过甲醇提取，分光光度法测定，分析了不同季节、不同桑种、不同品种桑叶总黄酮含量的差异。不同桑种总黄酮含量的比较分析为首次进行。结果表明：1 ) 育 71季叶片总黄酮含量显著高于春夏季，并且 10 月(霜前)含量略高于 11 月(霜后)。而实钴 11、秋叶片总黄酮含量差异不明显。 2) 不同桑种桑叶总黄酮含量差异极显著。长穗桑（及华桑（桑叶总黄酮含量极显著的高于其它桑种；白桑（桑叶总黄酮含量极显著的低于其它桑种。 3) 同属华桑的不同桑种质，其桑叶总黄酮含量仍然存在明显差异，含量最高的为保靖 4 号（含量为 mg/g），含量最低的为德江 15 号（含量为 mg/g）。除保靖 4号含量特别高以外，其余种质总黄酮含量差异没有不同桑种之间那么悬殊。从这些种质的原产地来看，同一原产地的种质总黄酮含量相近。 4) 同属白桑的不同桑种质，其桑叶总黄酮含量也存在显著差异，含量最高的为白桑 8 号（含量为 mg/g），含量最低的为桑莲（含量为 mg/g） 。除白桑 8 号含量较高以外，其余种质的含量都较低，开差也不大。5 ) mg/g，华桑总黄酮含量平均值为 mg/g，白桑总黄酮含量平均值为 mg/g，再次证明了华桑的总黄酮含量较高，而白桑的总黄酮含量较低。 关键词： 桑叶 次生代谢产物 化学成分 分离鉴定 总黄酮含量 is of is an It so as et to of in is of in 5 of is of is 52 713 004. is 5 000 000 In to of of of 21 16 of as 5, 7, 2, 4 18), 7 15), 13), 7 5, 7, 4 2, 3, 11 9 14 3 18) 10 (13) 4 15) 2 9 (15), 11, 12, 16, 19 4 is a is a of of FC of 1) FC u 71-1 in in no in FC 1-6 in 2) of FC FC of FC 3) FC of mg/g), 5 mg/g) of FC t so FC 4) FC of mg/g), mg/g) of 5) FC of mg/g, mg/g, mg/g. It FC FC 录 第一章 文献综述 植物化学成分研究概述 化学成分的提取 化学成分的分离 化学成分的结构鉴定 化学成分的合成 桑树次生代谢产物研究进展 桑叶 桑根 桑枝、桑果 其它 组织培养合成桑树次生代谢产物 桑树药理作用研究进展 对血糖血脂的影响 抗氧化活性 抗肿瘤活性 抗菌抗炎活性 抗凝血活性 其它活性作用 今后研究展望 1 1 1 1 4 6 6 7 10 11 12 13 13 14 16 18 18 19 20 21 研究目的和内容 研究目的和意义 研究内容和方法 研究内容 研究方法 第三章 桑叶次生代谢产物分离鉴定 仪器与实验材料 提取分离 化合物结构解析 化合物的理化常数和波谱数据 第四章 桑叶总黄酮含量分析 黄酮类化合物研究概况 试验方法建立 试验方法考察 样品含量测定 第五章 结论 参考文献 附图 致谢 攻读博士学位期间发表的论文 作者简介 22 22 23 23 23 24 24 24 27 64 68 68 71 78 81 91 93 100 124 125 126 词 畸变极化转移增益 二甲基亚砜 喷雾电离质谱 萄糖 1(检出1核多键相关谱 1检出1核单量子相干谱 红外光谱 熔点 磁共振谱 薄层色谱 第一章 文献综述 第一章 文献综述 植物化学成分研究概述 植物来源的天然药物是药物的一个重要组成部分。本草纲目中记载的天然药物有 1892 种，清赵学敏编著的本草纲目拾遗又补充了 1021 种。随着生命科学的进步以及人体自身机能调节系统的不断阐明，许多内源性生理活性物质正在不断被揭露出来，在此基础上人们运用在酶、受体、细胞、分子乃至基因调控水平上建立起来的新的生物活性测试体系进行广泛的筛选，还将会发现更多的天然药物。 天然药物之所以能够防病治病，其物质基础在于所含有的有效成分，这些成分大多为植物次生代谢的产物。然而一种天然药物往往含有结构、性质不尽相同的多种成分，这也给天然药物的成分分析和加工带来了一定的麻烦。在加工生产过程中，要注意设法除去那些无用的杂质，以得到富集有效成分的制剂，甚至直接得到这些有效成分的纯品。 运用现代科学理论与方法研究天然药物中化学成分的学科就是天然药物化学，其研究内容包括各类天然药物化学成分（主要是生理活性成分和药效成分）的结构特点、物理化学性质、提取分离方法以及主要类型化学成分的结构鉴定知识等，此外，还涉及主要类型化学成分的生物合成途径等内容（姚新生，2001）。 化学成分的提取 从天然药物中分离出所含的有机化学成分，国外文献一般记载，系以瑞典药剂师、化学家舍勒（K. W. 1769 年将酒石（酒石酸氢钾）转化为钙盐，再用硫酸分解制得酒石酸作为开端（姚新生，2001 ） 。后来，舍勒又用类似的方法从天然物中得到了苯甲酸、乳酸、苹果酸、没食子酸等有机酸类物质。 提取天然活性成分的方法有溶剂法、水蒸气蒸馏法及升华法等，后两种方法的应用范围十分有限，大多数情况下是采取溶剂提取法。一般而言，植物成分中，萜类、甾体等脂环类及芳香类化合物因为极性极小，易溶于氯仿、乙醚等亲脂性溶剂中；而糖苷、氨基酸等成分则极性较大，易溶于水及含水醇中；至于酸性、碱性及两性化合物，因为存在状态（分子或离子形式）随溶液而异，故溶解度随 改变。 由于存在多种成分间的相互助溶作用，实际情况往往比较复杂，一般是按极性递增方式，用不同溶剂，如石油醚或汽油（可提出油脂、蜡、叶绿素、挥发油、游离甾体及三萜类化合物） 、氯仿或乙酸乙酯（可提出游离生物碱、有机酸及黄酮、香豆素的苷元等中等极性化合物） 、丙酮或乙醇、甲醇（可提出苷类、生物碱盐以及鞣质等极性化合物）及水（可提取氨基酸、糖类、无机盐等水溶性成分）依次进行提取，得到的各个馏分再做进一步分离。 化学成分的分离 1中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 1） 根据物质溶解性差别进行分离 主要方法有以下几种： 改变溶解度 常常利用温度不同引起溶解度的改变以分离物质，如结晶、重结晶等。 改变溶液极性 一般是在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部分物质沉淀出来，从而实现分离。例如在浓缩水提液中加入数倍量高浓度乙醇，以沉淀除去多糖、蛋白质等水溶性杂质（水/醇法）；或在浓缩乙醇提取液中加入数倍量水稀释，放置以沉淀除去树脂、叶绿素等水不溶性杂质（醇/ 水法）。 改变溶液 对酸性、碱性或两性有机化合物来说，常可通过加入酸、碱以调节溶液的 ，改变分子的存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。比如在酸性水提液中加入碱调至碱性可使生物碱沉淀析出。 盐沉 酸性或碱性化合物还可通过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类等沉淀析出。比如生物碱可做成苦味酸盐、苦酮酸盐等有机酸盐。得到的有机酸盐沉淀悬浮于水中，加入无机酸，使有机酸游离后先用乙醚萃取除去，然后再进行碱化、有机溶剂萃取，回收有机溶剂即可得到纯化了的碱性有机化合物。 2） 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 简单液液萃取法 逆流分溶法（ 一般分配因子 50 时，简单液液萃取即可解决问题。而 50 时，则宜采用逆流分溶法。是一种多次、连续的简单液液萃取分离过程。此法操作条件温和、样品容易回收，特别适合于中等极性、不稳定物质的分离。但样品极性过大、过小，或分配系数受浓度或温度影响过大时不宜采用此法分离；易于乳化的溶剂萃取单元系统也不宜采用。 液液分配柱色谱 这是由逆流分溶法发展而来的一种分离方法。将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上作为固定相填充在色谱管中，然后加入与固定相不相混溶的另一相溶剂（流动相）冲洗色谱柱，物质就在两相溶剂相对作逆流移动过程中不断进行动态分配而得以分离。 液滴逆流色谱法（由液液分配色谱发展而来。可使流动相以液滴形式垂直上升或下降，通过固定相的液柱，实现物质的逆流色谱分离。 高速逆流色谱（ 是一种不用任何固态载体或支撑体的液液分配色谱技术。术分离效率高、产品纯度高、不存在载体对样品的吸附和粘染，具有制备量大和溶剂消耗少等优点。1994 年， 第一章 文献综述 技术创始人 Y. I t o 博士又发明了 进样量大增加，能方便快速的分离克数量级样品，更有利于化学成分的分离制备。 3） 根据物质的吸附性差别进行分离 在天然有机化合物分离与精制过程中，吸附现象利用得十分广泛。其中又以固- 液吸附用得最多，并有物理吸附、化学吸附和半化学吸附之分。物理吸附（叫表面吸附，是因构成溶液的分子（含溶质及溶剂）与吸附剂表面分子的分子间力的作用所引起。特点是无选择性，吸附与解吸附过程可逆，且可快速进行，故在实际工作中用得最广。 硅胶柱吸附色谱 这是实际工作中用得最多的一种分离方法。能用于非极性化合物，也能用于极性化合物，可适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸等。硅胶用量一般为样品量的 3060 倍，样品极性较小、难以分离者，硅胶用量可适当提高至样品量的 100200 倍。装柱和溶解样品应尽量选用极性小的溶剂，以利样品在柱上形成狭窄的原始谱带。 聚酰胺吸附色谱 聚酰胺吸附属于半化学吸附，是一种用途十分广泛的分离方法，特别适合于分离酚类、醌类、黄酮类化合物。此外，对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等其它极性与非极性化合物的分离也有着广泛的用途。聚酰胺对鞣质的吸附特强，近乎不可逆，故也可用于植物粗提物的脱鞣处理。聚酰胺色谱柱分离时，通常用水装柱，样品也尽可能作成水溶液上柱，以利聚酰胺对溶质的充分吸附，随后用不同浓度的含水醇洗脱，并不断提高醇的浓度，逐步增强从柱上洗脱物质的能力。 4） 根据物质分子大小差别进行分离 常用有透析法、凝胶过滤法、超滤法、超速离心法等。前两者系利用半透膜的膜孔或凝胶的三维网状结构的分子筛过滤作用；超滤法是利用因分子大小不同而引起的扩散速度的差别；超速离心法则是利用溶质在超速离心作用下具有不同的沉降性或浮游性。 凝胶过滤法（是利用分子筛分离物质的一种方法。其中所用载体是在水中不溶、但可膨胀的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。当在水中膨胀后装入色谱柱中，加入样品混合物，用同一溶剂洗脱时，由于凝胶网孔半径的限制，大分子将不能渗入凝胶颗粒内部，故在颗粒间隙移动，并随溶剂一起从柱底先行流出；小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部，故通过色谱柱时，阻力增大、流速变缓，将较晚流出。样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入至凝胶颗粒内部的程度不尽相同，故在经历一段时间流动并达到动态平衡后，即按分子由大到小顺序先后流出并得到分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶（、丙烯酰胺凝胶（ ）、琼脂糖凝胶（ ）以及羧甲基交联葡聚糖凝胶（、二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶（、磺丙基交联葡聚糖凝胶（、苯胺乙基交联葡聚糖凝胶（等结合了不同离子交换基团的葡聚糖凝胶衍生物。 5） 根据物质解离程度不同进行分离 3中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 天然有机化合物中，具有酸性、碱性及两性基团的分子，在水中多呈解离状态，据此可用离子交换法或电泳技术进行分离。 离子交换法是用得较多的一种方法。以离子交换树脂作为固定相，用水或含水溶剂装柱。当样品水溶液通过交换柱时，溶液中的中性分子及与离子交换树脂上的交换基团电荷相反的离子将通过柱子从柱底流出，而那些与树脂上交换基团电荷相同的离子将与树脂上的交换基团进行离子交换，并被吸附到柱上，随后改变条件，并用适当溶剂从柱上洗脱下来，即可实现物质分离。根据交换基团的不同，离子交换树脂可分为强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂、弱碱性阴离子交换树脂。 6） 几种新方法 超临界流体萃取（ 是一种以超临界流体（ 替常规有机溶剂对目标组分进行萃取和分离的新技术，其原理是利用流体（溶剂）在临界点附近某区域（超临界区）内与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能，且对溶质的溶解能力随压力和温度的改变而在相当宽的范围内变动来实现分离的。利用溶剂，可以从多种液态或固态混合物中萃取出待分离组分。由于 易燃易爆、价廉、临界压力和温度较低、易于安全地从混合物中分离出来等优点，所以 同沸点的化合物，几乎保留产品中全部有效成分，无有机溶剂残留，其产品纯度高。 超滤膜分离 是一种以多孔性半透膜为分离介质的膜分离技术，具有分离不同分子量分子的功能。其特点是，有效面积大、滤速快、不易形成表面浓差极化现象、无相态变化、低温操作、破坏有效成分的可能性小、能耗低等。 大孔吸附树脂分离 大孔吸附树脂是吸附性和分子筛性原理相结合的分离材料，吸附性是由于范德华力或产生氢键的结果，分子筛性是由于其本身多孔性结构的性质所决定。因其理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，所以在天然化合物的分离与富集工作中被广泛应用。样品一般用水溶液上柱，洗脱时根据吸附作用强弱不同选用不同浓度的甲醇、乙醇等含水溶剂，直至纯的甲醇、乙醇，乃至丙酮、乙酸乙酯等。对非极性大孔树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强。对于中等极性的大孔树脂和极性较大的化合物来说，则以选用极性较大的溶剂为宜。 化学成分的结构鉴定 结构研究是植物化学成分研究的一项重要研究内容。从植物中分离得到的单体即使具有很强的活性与较大的安全性，但如果其结构不清楚，则无法进一步开展其药效学和毒理学研究，也不可能进行人工合成或结构修饰、改造工作，更谈不上进行高质量的新药开发研究。 近年来新技术的应用，特别是核磁共振谱与质谱的应用，有力的促进了结构鉴定工作的开展。综合运用紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱与质谱能够迅速准确地定出一个化合物的分子式、结4中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 构类型，有些简单化合物则可直接鉴定出全部结构，且用量在毫克乃至微克水平。 1） 质谱（ 质谱是记录分析样品在质谱仪中经高温气化，在离子源受一定能量冲击，失去电子，生成阳离子，而后在稳定磁场中按质量与电荷之比（ m/z）顺序进行分离，通过检测器而记录的图谱。每个峰代表一个质量数。一般可根据质谱提供的分子离子峰的碎片峰的质荷比确定分子量与推导结构。根据分子离子峰（通常在最高处，即图谱的右边）配合元素组成的分析值，或利用它的同位素峰的比例（离子峰后 14 位以内），确定分子式，其它各峰是碎片峰，峰高代表离子的相对含量。 由于在一定条件下化合物的开裂还遵循一定规律，故比较样品与标准品在同一装置、同一条件下测得的 ，可以鉴定是否为同一化合物。根据电离方法差异，可分为电子轰击（化学电离（、场致电离（、场解析电离（、快速原子轰击电离（ 、电喷雾电离（等法。 2） 红外光谱（ 分子中价键的伸缩及弯曲振动将在光的红外区域（ 4000625引起吸收。其中40001500 ，许多特征官能团如羟基、氨基以及重键（如C=C 、 C C、 C=O、 N=O） 、芳环等吸收均出现在这个区域，并可据此进行鉴别。1500，其中许多吸收因原子或原子团间的键角变化所引起，形状比较复杂，犹如人的指纹，可据此进行化合物的真伪比较鉴别。 3） 紫外- 可见吸收光谱（ 谱对于分子中含有共轭双键、 , 、酸、酯结构的化合物以及芳香化合物的结构鉴定来说是一种重要的手段。通常主要用于推断化合物的骨架类型；某些场合下，如香豆素类、黄酮类化合物的 谱在加入某种诊断试剂后可因分子结构中取代基的类型、数目及排列方式不同而改变，故还可用于推断化合物的精细结构。 4） 核磁共振谱（ 常用的有氢核磁共振（1、碳核磁共振（13，是测定有机化合物结构的重要方法。近年来发展起来的二维核磁共振（2由于信号相对较简单，图象解析比较容易，在实际测定工作中取得了很好的效果。 5） 旋光光谱（ 用不同波长的偏振光照射光学活性化合物，并用波长对比旋 1010到的曲线即为旋光光谱，常见的有平坦谱线、单纯 合应谱线。旋光光谱及其应谱线特征与分子的立体化学结构有重要的关联，因此可用来确定未知化合物的立体结构。 5中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 化学成分的合成 1） 生物合成 研究相关化学成分的生物合成，不仅对次生代谢产物进行结构分类或者推测其结构有所帮助，而且对植物化学分类学及仿生合成等学科都有重要的理论指导意义，对采用组培进行次生代谢产物的生产也有实际指导意义。主要的生物合成途径有以下几种： 醋酸丙二酸途径（径） 脂肪酸类（、酚类（ 蒽酮类（等类化合物均由这一途径生成。 甲戊二羟酸途径（径） 萜类（、甾类（物质由这一途径生成。 桂皮酸途径（及莽草酸途径（ 天然化合物中具有 、香豆素类（ 、木质素类（、木脂体类（以及具有的经苯丙氨酸脱氨酶（脱去氨后生成的桂皮酸而来。 氨基酸途径（ 生物碱类成分均由此途径生成。有些氨基酸脱羧成为胺类，再经过甲基化、氧化、还原、重排等一系列化学反应后即转变成为生物碱。 复合途径 有些结构复杂的次生代谢产物，其分子中各个部分不可能来自同一生物合成途径，比如查尔酮类（、二氢黄酮类（等化合物就是如此。常见的复合途径主要有醋酸- 丙二酸莽草酸途径、醋酸- 丙二酸甲羟戊酸途径、氨基酸甲羟戊酸途径、氨基酸醋酸基酸莽草酸途径等。 2） 细胞培养生产次生代谢产物 天然活性物质大都为植物体内的次生代谢产物，它们是细胞生命活动或植物生长发育正常进行的非必需化合物，其产生和分布通常有种属、器官、组织及生长发育时期的特异性，并且其含量往往不是太高。从天然植物中提取这些活性物质，往往会导致对野生植物的盲目采集，加剧生态环境的破坏。而采用化学合成，其工艺流程较复杂，并且易产生同分异构体。 近年来发展起来的细胞大量培养生产植物次生代谢产物，不仅可以通过诱变、细胞工程或基因工程等技术筛选高产细胞株，可以将某种前体或价值较低的化合物转化成价值较高的化合物，通过代谢的调控探索新的生物合成路线并获得新的活性物质，而且能迅速实现规模化生产天然活性物质。通过细胞大量培养已生产出了抗虐疾有效成分青蒿素（、抗菌抗病毒有效成分紫草宁（抗肿瘤有效成分紫杉醇（等天然活性物质。