【毕业学位论文】表达FMDV vp1 基因的重组山羊痘病毒的构建及其生物学特性研究博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 表达 因的重组山羊痘病毒的构建及其生物学特性研究 on of a 士研究生: 王 芳 指导教师: 陈洪岩 研究员 申请学位类别: 农学博士 专业: 预防兽医学 研究方向: 动物病毒分子生物学与分子免疫学 培养单位: 中国农业科学院研究生院 哈尔滨兽医研究所 提交日期 2007 年 6 月 on of a 007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 表达 因的重组山羊痘病毒的构建及其生物学特性研究 论文作者 王 芳 指导教师 陈洪岩 培养单位 哈尔滨兽医研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 吴 润 教授 博士导师 甘肃农业大学 预防兽医 李一经 教授 博士导师 东北农业大学 预防兽医 评 阅 人 魏 萍 教授 博士导师 东北农业大学 预防兽医 答辩 主席 华育平 教授 博士导师 东北林业大学 野生动物 疾病防制 刘文周 教授 博士导师 东北农业大学 预防兽医 师东方 教授 博士导师 东北农业大学 预防兽医 童光志 研究员 博士导师 哈尔滨兽医研究所 预防兽医 刘胜旺 研究员 博士导师 哈尔滨兽医研究所 预防兽医 于 力 研究员 博士导师 哈尔滨兽医研究所 预防兽医 曲连东 研究员 博士导师 哈尔滨兽医研究所 预防兽医 答 辩 委 员 答辩时间与地址 2007/06/16 哈尔滨兽医研究所学术报告厅 记录人员 高玉龙 要 山羊痘（ 由山羊痘病毒（ 起的一种急性、热性、接触性传染病。 本病以发热、 无毛或少毛部位皮肤黏膜发生丘疹和疱疹以及淋巴结病变为主要特征，被世界动物卫生组织列为 我国从 40年代起出现了绵羊痘和山羊痘的感染与流行，近几年我国各地特别是内蒙、西部地区常有羊痘感染的报道。该病发病率高，可导致妊娠母羊流产，羔羊死亡率高，并有非典型症状及继发、并发感染的情况。羊痘在我国的广泛流行，给我国养羊业以及毛皮加工行业的发展造成了极大的经济损失。目前对于羊痘尚无特异的治疗方法，主要依靠疫苗接种来预防。弱毒疫苗免疫效果比较好，而且免疫保护期长，但是现有诊断方法无法区分自然感染和弱毒疫苗免疫的动物，给疾病的鉴别诊断带来了困难。 口蹄疫（ 由口蹄疫病毒（ 起猪、牛、羊等偶蹄兽的一种急性热性高度接触性传染病，严重危害家畜的生产力和畜产品质量，给畜牧业和进出口贸易造成较大的经济损失，成为世界各国检疫和防疫的重点对象，同样被世界动物卫生组织列为 然山羊和绵羊不如牛和猪易感，但是山羊和绵羊感染 为隐性带毒者，这给该病的防制增加了难度。因此，山羊和绵羊在 暴露在病毒颗粒的表面，具有与细胞受体结合的位点，是病毒感染细胞的关键，而且 此 本研究以我国广泛使用的山羊痘弱毒疫苗株 1为亲本病毒， 以胸苷激酶 （ 因为外源基因插入位点，构建重组山羊痘病毒。首先，克隆 其克隆至 到重组质粒 测序和序列分析显示， 96码病毒膜蛋白； 444个碱基重叠。 34码胸苷激酶（ ，具有保守的 94码宿主范围相关蛋白。与 苷酸和氨基酸同源性均较高（ 100%） 。其中 00%，与国内分离株同源性为 100%。以上结果表明， 构建重组山羊痘病毒基因工程疫苗理想的亲本毒株。 在以上研究的基础上，首先构建表达报告基因 将痘苗病毒晚期启动子 位点，构建了含报告基因 后，通过脂质体法将 胞，经过连续 5轮蓝斑筛选、纯化以及 得了一株表达 胞上连续传 25代，并进行 毒滴度测定。结果显示， 明该重组病毒性状稳定， 在成功构建了表达 重组病毒 后，以 O 型 因作为构建重组病毒的靶抗原，以 亲本毒株，反向蚀斑筛选以除去 因，获得了表达 实验将痘苗病毒早 /晚期启动子 制下的 O 型 因表达盒插入到 移载体 位点，构建了含 因的转移载体 亲本毒株，脂质体法将 染 胞，经过连续 6 轮反向蚀斑筛选、纯化，经 定获得了一株重组病毒 因 物进一步测序验证。经接免疫荧光和生长动力学检测， 染的细胞可以被 法检测到 白的表达，用 异性抗体可以检测到 染的细胞胞浆内荧光。与疫苗株比较，二者增殖特性无明显差异，在 胞上形成的蚀斑大小和形态相同。将 胞上连续传 12 代， 并对 因进行 测、 病毒滴度测定、 测。结果表明， 因稳定表达， 胞上的病毒滴度和细胞病变与 明显差异，表明 因的插入并没有改变 细胞培养中的生长特性， 持了亲本毒株的生物学特性，可以作为研制山羊痘基因工程疫苗的候选毒株。 关键词 ：山羊痘病毒 胸苷激酶 重组病毒 口蹄疫病毒 on of , is a of by is by in of in of of It a in of is of of in In in of of by on is a of It in as as an as P1 of P1 a in to In we PV as as PV P1 by of we as PV 8-T 96 44 34 K 94 PV of 00%. of K 00%, 00% PV so it as to of 11 by of to a PV as A PV as of CR CR CR 5th T K no on of as of 7.5 by of to a PV as A PV P1 as of CR CR of P1 by T T P1 be in no to of T T T P1 he of be a to of PV to to a of In is is a to 录 第一章 绪论 . 1 痘及羊痘病毒 . 1 痘概况 . 羊痘病毒的生物学特性 .组痘病毒的研究 . 9 建重组病毒的原则 . 构建重组病毒的方法 . 11 高重组痘病毒免疫效力的策略 . 羊痘病毒作为病毒载体的优点 . 重组羊痘病毒的研究现状 .蹄疫病毒重组活载体疫苗的研究 . 17 究的目的和意义 . 18 第二章 山羊痘病毒疫苗株 克隆及其序列分析 . 20 料与方法 . 20 胞与毒株 . 载体与菌株 . 生化试剂及试剂盒 . 主要仪器设备 . 引物设计 . 犊牛睾丸细胞的制备 . 基因片段的克隆与鉴定 . 核苷酸与氨基酸序列分析 .果 . 24 因的 隆及鉴定 . 基因序列分析 .论 . 33 . . . .三章 表达 . 36 料与方法 . 36 胞与毒株 . 载体与菌株 . 生化试剂及试剂盒 . 主要仪器设备 . 引物设计 . 转移载体的构建 . 转染和重组病毒筛选 . 重组病毒的 . 重组病毒的生物学特性 .结果 . 40 移载体 . 重组病毒的纯化与 . 重组病毒的生物学特性 .论 . 45 组病毒的构建及筛选 . 基因缺失疫苗的应用前景 .四章 表达口蹄疫病毒 因的重组山羊痘病毒的构建及其生物学特性研究 . 47 料与方法 . 47 胞与毒株 . 载体与菌株 .化试剂及试剂盒 . 主要仪器设备 . 引物设计 . 因的 . 转移载体的构建 . 转染和重组病毒筛选 . 重组病毒的鉴定 .0 重组病毒的生物学特征 .果 . 52 因的 .