【毕业学位论文】甘蓝型油菜低磷胁迫应答cDNA的差异表达分析硕士论文

摘 要 磷是植物所必须的大量元素之一，土壤中有效磷的浓度偏低(2) ，已成为作物生长的重要限制因子。油菜是全球重要的油料作物之一。而油菜是对磷敏感的作物，缺磷导致油菜产量和品质下降，因此培育耐低磷作物新材料已迫在眉睫。 为进一步揭示油菜耐低磷机理以及其耐低磷性的遗传基础，本工作以大田筛选的耐低磷油菜和磷敏感油菜品种为材料，研究磷素营养特征以及它们在低磷胁迫前后基因表达情况。主要工作内容与结果如下： 护酶活性和叶绿素含量的变化 研究表明耐低磷品种的性在实验期间相对稳定，而低磷敏感品种在低磷胁迫初期有明显的增加，尔后又快速下降，这表明保护酶的绝对活力与低磷胁迫无关，而变化趋势与低磷胁迫有关。低磷引起耐低磷品种增量明显小于低磷敏感品种，而叶绿素含量在整个胁迫期间并没有显著变化。 实验对油菜差别显示体系进行了筛选，最终获得了优化的差别显示体系。即 火温度在40扩增条带清晰。 研究用银染 异显示技术分析了耐低磷油菜品种中油 821 和磷敏感品种 1182 在低磷胁迫前后基因的差异表达情况。共获得差异表达 段 61 个。从中挑选差异显著的 16 个片段进行克隆分析，它们在低磷胁迫下表达增强或受到抑制。 拟南芥编码木葡聚糖转葡糖苷酶基因相似达到 85%。推测的光合系统 型 I 叶绿体 a/b 结合蛋白基因同源性很高，码的产物为 合蛋白。低磷胁迫还调动了蛋白质合成与代谢( 核糖体蛋白基因、 绿体核糖体大亚基蛋白基因) 及其与胁迫相关的 相关基因的差异表达。还有一些未知功能的基因( 需进一步研究。 析 导的氨基酸序列是叶绿体 a/b 结合蛋白靠近 3端一保守区， 交及半定量析表明该基因低磷胁迫 6h 后表达增强。 段推测的氨基酸序列与拟南芥核糖体结构蛋白的相似性为 98%。析表明该基因在胁迫后 6h 表达增强。核苷酸序列与拟南芥的类囊体膜蛋白磷酸酯酶的基因同源性较高，且在胁迫后 24h 表达量最大。 测的氨基酸序列与拟南芥木葡聚糖转葡糖苷酶(似性为 88%，植物根毛形成过程中起到非常重要的作用，半定量 析表明该基因在磷敏感品种 1182 根中受低磷胁迫的抑制。 段推测的 44 个氨基酸序列与拟南芥的 白有较高的同源性，该蛋白位于线粒体内膜上，参与电子传递。 关键词：油菜，低磷胁迫， 别显示，应答 定量 I P) is of by i in is 2 0) of is of in is . of of p it is to by In is to of of of of to by as 1. of on of of OD in ob at in of no e. DA in in is 2. of of he NA g of 0, 3. of of n in o. 821 by 1 16 or of 5% to of to I a/b of NA In a of in to as of 21) in to as in 6、 15 9), to be 4. of he of of to I a/b in of 5% NA of of in on of it is 4 of in of by by 4 of 8% of in by of 4 of in in 目 录 第一章 文献综述 .物对低磷胁迫的适应机制 . 2 物对难溶性磷的活化 . 植物根系与磷吸收有关的机制 . 植物体内的磷元素运输及其再利用 .物在低磷胁迫下的应答基因 . 6 磷胁迫下的信号转导 . 低磷胁迫下早期应答基因 . 低磷胁迫下的晚期应答基因 .3 . 12 . . . .菜磷高效研究进展 . 15 束语 . 15 第二章 油菜叶片低磷胁迫下生理指标的变化 .言 . 17 料与方法 . 17 果与分析 . 19 磷胁迫对不同油菜品种量的影响 . 低磷胁迫对不同油菜品种性的影响 . 低磷胁迫对不同油菜品种叶绿素含量的影响 .论 . 22 第三章甘蓝型油菜低磷胁迫应答差异表达分析 .言 . 23 料与方法 . 23 验材料 . 主要仪器 . 实验方法 .果与分析 . 31 染的 . . 差异片段的重扩增 . 差异表达. 差显片段的半定量. 差显片段交分析 .讨论 . 39 种基因差异表达研究的方法比较 . 银染的 . 差异表达片段分析 .四章 全文结论 .考文献 . 谢 . 者 简 历 . 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 性磷酸酶 异显示 碳酸二乙脂 高辛 异消减展示 二胺四乙酸 黄素腺嘌呤二核苷酸 丙基 二醛 硫氨酸 -(-( 丙磺酸 膜区 蓝四唑 合酶链式反应 磷酸盐 表性差异显示 糖核酸酶 二烷基磺酸钠 氧化物歧化酶 化钠/ 柠檬酸钠缓冲液 基奎诺基二酰基甘油 制性消减杂交 羟甲基氨基甲烷 氯乙酸 录因子 葡聚糖转葡糖苷酶 第一章文献综述 第一章 文献综述 引言 磷是核酸和生物膜的能量代谢和生物合成的重要底物之一，并在光合作用、呼吸作用及一系列酶的调节作用中起着重要作用，磷虽不是脂肪的组成元素，但脂肪的合成也需要磷参加。磷脂主要储存在种子，尤其在种胚中，磷脂可促进油脂乳化，有利于脂肪代谢。在植物必需的有机营养元素中，磷是显著影响植物生长和新陈代谢的最重要因素之一。 全球土壤含磷量高低不一和植物本身对磷吸收利用率偏低等因素，造成作物的产量和品质降低，因而成为影响各国农业生产的严重问题之一。单凭增施磷肥不能从根本上解决这一问题，因为磷肥的大量生产受到资源和经济状况的限制，而且磷肥施入土壤后的利用效率只有 10 15%，其余均转化为植物难以吸收利用的难溶性磷。此外，大量施用磷肥还会造成环境污染。 目前，对于作物磷营养基因型差异的可能机理已有一些研究报道。 983)研究表明，磷高效品种在低磷介质中能比磷低效品种吸收和积累更多的磷，这是通过一些形态和生理上的变化差异来实现的。缺磷胁迫下，植物会产生一系列的包括根系形态及生理方面的适应性变化。在缺磷逆境中最先感受养分胁迫的器官是根系。磷在土壤中的移动性很小在此情况下根系通过形态学的变化如根的长度和粗细、根毛和侧根的数量和密度等来扩大根系与土壤磷的接触面积，以提高植物对磷的吸收效率( 001；，2001 ；，2002； 004)。而低磷下根冠比的增加则为整个根系的发育提供了物质保障。此外，在缺磷条件下，植物根系会产生大量分泌物，包括 ， 1990； ， 1993； ， 1994)、酸性磷酸酶（， 1993；，2001 ；，1989；李峰等，2004) 、有机酸(， 1996； ， 1991； ， 2004；李德华等， 2005)等，这些分泌物对活化外界环境中的难溶性磷起到非常重要的作用。高等植物在低磷胁迫下，根系细胞质膜会表达一种高亲和力的磷酸盐转运蛋白，该转运蛋白可有效吸收外界环境中低浓度的磷元素。在缺磷胁迫条件下，植物也可增强体内磷元素的再循环利用，即把衰老组织中的磷转移至生长组织中，实现体内的磷元素再分配，这也是植物适应磷胁迫的一种生理学机制。植物体内磷元素再循环利用率在不同植物和同一植物不同品种之间存在差异。990) 、(1990) 、段海燕等(2002)、张丽梅等(2005) 分别研究冬小麦、高粱、油菜、玉米时，发现磷高效品种体内磷元素的再运输和再利用率高，并能在较低浓度磷的条件下进行生长发育，经济产量也较高。 对于植物磷效率的受控基因尚不十分明确，特别是对制约磷效率的基因片段还未完全查明与准确定位，但近年来以模式植物拟南芥( 主要材料，对于植物耐低磷的分子生物学机制研究取得了很大进展，许多磷胁迫诱导的基因被克隆。最近，应用微阵列技术研究低磷胁迫诱导表达的基因（2003； 2002；，2004；， 2003；，2005 ；， 2006）。这些基因的表达包括通常的逆境胁迫相关的基因以及磷特异性的信号转导途径。（ 2003）通过 阵列分析缺磷条件下白羽扇豆排根的基1中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 因表达特征时，发现与碳代谢、次生代谢、信号传导及磷摄取等过程相关的众多基因呈现明显的差异表达。现在已经克隆的与低磷胁迫相关的基因可分为早期基因和晚期基因，早期基因是对低磷胁迫的快速反应，并且通常没有特异性，大部分是调控基因表达的转录因子。从低磷胁迫的西红柿中克隆到的一个顺式调控元件 与酵母的 合区()同源性较高。苜蓿中同源的基因 南芥中的 水稻的 经鉴定 (，1999；， 1997； ， 2000)。这些基因编码一些短的开放阅读框，具有核酸调节子(似的功能，调控其他大分子如 及蛋白质的功能。所有已经鉴定的与低磷相关的顺式调控元件能作为蛋白的结合位点，这些蛋白控制植物对缺磷胁迫的内部反应。晚期基因是有关形态学，生理，或者代谢的，它们通常能够提高植物对磷的吸收和利用效率(， 2003)。(1999) 从莨菪( .)须根上已克隆到 因，它在转基因莨菪根系的过量表达可促进侧根的形成和根量的激增。控制有机酸的分泌的 因已经成功地得到克隆 (，1999) 。在植物磷吸收中起到非常重要作用的磷酸盐转运蛋白基因（ 2002； ， 2004； ， 2005； ， 2004）、 因 (994)、因(1999； 2002；肖凯等，2006) 等有了较为深入地研究。 物对低磷胁迫的适应机制 磷元素是植物所必须的大量元素之一，土壤中有效磷的浓度偏低(2) （1999），已成为作物生长的重要限制因子。就磷肥利用效率而言，一般作物当季利用率只有10%其余则沉积在土壤中被矿物和有机物所固定，但绝大部分从农田耕作层流失掉。因此，通过改变作物自身性状来提高作物对土壤磷的利用能力就成为实现农业可持续发展的关键。 植物耐低磷性状涉及根形态、根分泌物、膜与体内磷转运等许多方面，表现为数量遗传性状及受多基因控制。近年来植物耐低磷机制及与其有关分子生物学研究取得了迅速进展。 物对难溶性磷的活化 植物活化难溶性磷的机制主要的有 2 种。一是利用土壤中的难溶性有机磷的机制，即通过根系分泌的酸性磷酸酶(水解有机磷以释放及水解放，另一是与利用难溶态无机磷(等) 的机制，即通过根系分泌有机酸 (主要是柠檬酸、苹果酸、草酰乙酸、琥珀酸等 )来螯合 与活化土壤中难溶性有机磷有关的酶 酸性磷酸酶(普遍存在于植物体内，这类酶可催化分解磷酸单酯等含磷有机化合物并释放出无机磷(。植物也能分泌酸性磷酸酶到根际，以分解土壤有机磷并释放出无机磷供植物吸收利用，因而胞外酸性磷酸酶的分泌与植物磷营养效率也有一定的关系(2002)。番茄 (.)、玉米( .)、白羽扇豆( 中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 、水稻( .)中的研究均表明，缺磷会诱导 根系分泌(， 1993；，2001；， 1989；李峰等，2004) 。低磷胁迫诱导的分泌性 一种复杂的化合物，具有几种同工酶，常形成聚合体发挥作用。人们已从低磷条件悬浮培养的烟草细胞中分离到 2 个具有双酯酶活性的中性焦磷酸酶，它们的最适 外分离出 1 个随着低磷诱导而活性增强的 酶有广泛的作用底物，最适 平等，2001) 。从模式豆科植物截叶三叶草( 克隆的一个新型紫色酸性磷酸酶(因，并通过转基因技术获得了超量表达 拟南芥转基因植株。在以植酸盐为唯一磷供源条件下，超量表达 拟南芥转基因植株的生物学产量、植株无机磷含量和全磷含量明显高于野生种( 肖凯等，2006) 。 虽然酸性磷酸酶基因资源对于作物磷营养性状的遗传改良提供了一个方向，但有些植物如菜豆和豇豆中并未发现有随介质中磷浓度降低而分泌酸性磷酸酶，或其活性并不随磷浓度的降低而增高。另外，基因定位研究表明，酸性磷酸酶的诱导表达系统在耐低磷胁迫中可能有一定的作用，但不是重要因子，酸性磷酸酶可能对活化根际难溶磷起一定的作用，因此能否将根系分泌酸性磷酸酶能力作为磷利用效率的依据还需深入探讨。 酶，此酶参与细胞中的许多生理生化过程，与抗逆性和抗病性等密切相关。磷饥饿状态下，植物利用生长介质中的无效态有机磷的另一种机制就是性的显著增强，这包括细胞内和分泌到细胞外的。目前已从磷饥饿的马铃薯和番茄的悬浮细胞系以及拟南芥的根系中均发现诱导表达(990 ； 993 ； 1994)。分泌到细胞外的水解生长环境中的 而提高磷的生物有效性有一定的意义。而细胞内 解释放及与确保适应低磷状态相关的一些生理生化过程在转录、翻译水平上对植物自我拯救的机制之一。 与活化难溶性无机磷有关的有机酸分泌 低磷胁迫下根系分泌的有机酸( 如乙酸、顺乌头酸、柠檬酸、延胡索酸、苹果酸、草酰乙酸、琥珀酸以及丙二酸等) ，在将土壤中的难溶性无机磷活化为有效磷中起作用（图1 (006； 1996； 1991； 2004；李德华等， 2005)。白羽扇豆根系在缺磷条件下形成的排根大量地分泌柠檬酸能活化土壤中的，从而提高土壤中磷的可利用性( 田中民， 2001)。 989) 也发现，油菜根在缺磷胁迫下分泌的柠檬酸和苹果酸可达到正常供磷的6，是其活化难溶性无机磷的主要原因。(1981)利用钾- 铷射线研究膜透性与根渗漏量关系时提出膜透性变大可引起根渗漏量增加，他们认为这主要由根部磷脂含量决定。磷胁迫下，作物根部磷脂含量低，因此膜透性变大，根渗出液中柠檬酸量升高。 植物根系分泌有机酸到根际至少涉及3 个过程：(1) 信号产生与传递；(2) 有机酸的生物合成；(3)有机酸通过膜转运子( 阴离子通道) 释放到根际。因此，根系分泌有机酸的基因控制也比较复杂，由于有机酸合成分泌的具体流程尚未完全清楚，也就无法区分各环节上的控制基因，限速环节及3中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 其控制基因也无从区分，因而目前一般把根系分泌有机酸的性能看作是一种数量遗传性状，通常采用术研究其分子遗传(2002) 。不同小麦细胞分泌苹果酸的差异主要决定于质膜 图 1酸盐对土壤中难溶性磷的活化作用 1of on in 上阴离子通道转运速率，而不取决于细胞内苹果酸的合成速度，有人发现点可能编码苹果酸通道或非专一性阴离子通道，但点编码产物的功能目前尚未明确，低磷和高铝胁迫都能诱导其表达(， 1995)。白羽扇豆常作为研究根系分泌有机酸的模式植物，它的排根细胞里积累的柠檬酸是通过质膜上的阴离子通道转运出来的，释放量主要受阴离子通道的调节。合成柠檬酸所需要的碳源主要来自非光合作用碳固定的产物，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(这一碳供应途径中的限速酶。因此， 关的报道也很多。 中依赖丙酮酸激酶，因而只要很有限的可继续进行是根系分泌有机酸的重要来源之一(， 1994)。 物根系与磷吸收有关的机制 缺磷胁迫下植物根系的形态变化 植物在磷缺乏的情况下会通过提高有效的根表面积来加大吸收面积从而获得磷元素。植物在磷胁迫下侧根的密度和长度会增加而主根生长受到限制( 001；，2001； 2002； 2004)，并且根毛的数量和长度也会增加(， 2001)。虽然根系形态的可塑性大，但根系形态的发生与形成过程也受遗传控制( 1998)。近来，19种根突变体在低磷状态下的应答特征和根毛对缺磷变化的遗传学模型已经提出(4中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 2004)。研究表明，根系形态是受一系列能对根原基进行负调节的基因控制( 2001)。植物激素乙烯和生长素通过对根系细胞的特化基因下游的作用促进根毛分化以及侧根和不定根的形成(，1997) 。关于与乙烯转导途径有关的几个基因位点已通过对它们的突变体表型研究被确定。细胞分裂素能够促进茎的发育而抑制根的生长，低磷胁迫下降低根部细胞分裂素的水平可能会解除它对根的抑制作用，它是磷诱导的根生长负向调节子(，2000) 。 排根是一种特殊的根形态，它是在局部根段上大量萌生次级侧根所形成毛刷状根族(现已在豆科、山龙眼科、撵木科和杨梅科等植物上发现有排根发生，其中豆科的白羽扇豆成为研究排根的模式植物( 周志高等，2005) 。排根形成所提高的根系吸收表面积达数倍，同时排根的有机酸和酸性磷酸酶分泌以及排根的磷吸收速率也大大增强和加快，因而排根对植物磷元素以及其他营养元素的营养效率都产生很大的影响( 2003)。 003) 通过现与碳代谢、次生代谢、信号传导及磷摄取等过程相关的众多基因呈现明显的差异表达。但目前研究排根形成的遗传学基础及其基因调控机制还不多，将来可望通过突变体技术定位到控制排根形成的基因或一步探讨这一问题。研究根系形态学性状的遗传多样性及其基因控制，可能是植物磷营养性状的分子遗传改良的又一个极具应用潜力的方向。 与磷的吸收有关的磷酸盐转运蛋白 根部细胞的质膜是磷进入植