【毕业学位论文】口蹄疫病毒P12A-3C基因在百脉根中的表达及其免疫豚鼠试验硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 口蹄疫病毒 因在百脉根中的表达及其免疫豚鼠试验 12in in 硕士研究生 : 王炜 指导教师 : 张永光 研究员 申请学位类别: 农学硕士 专 业: 预防兽医学 研究方向 : 疫苗及免疫方法学 培养单位 : 研究生院 兰州兽医研究所 提交日期 2006 年6月 12in in s. 006 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 辩委员名单 论文题目 口蹄疫病毒 因在百脉根中的表达及其免疫豚鼠试验 论文作者 王 炜 指导教师 张永光 研究员 培养单位 兰州兽医研究所 姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 马军武 副研究员 硕导 中国农业科学院 兰州兽医研究所 预防兽医学王君伟 教授 博导 东北农业大学 预防兽医学评 阅 人 答辩 主席 邱昌庆 研究员 博导 中国农业科学院 兰州兽医研究所 预防兽医学胡永浩 教授 博导 甘肃农业大学 预防兽医学黄有德 教授 硕导 甘肃农业大学 临床兽医学吴润 教授 博导 甘肃农业大学 预防兽医学殷宏 研究员 博导 中国农业科学院 兰州兽医研究所 基础兽医学答 辩 委 员 答辩时间、地点 2006国农业科学院兰州兽医研究所学术报告厅 记 录 鲁炳义 要 口蹄疫（ 由口蹄疫病毒（引起的一种急性热性高度接触性传染病，对猪牛羊等家畜和许多野生动物危害严重。灭活疫苗对口蹄疫的防控起了巨大作用，但其弊端也不容忽视。近些年来，新型口蹄疫疫苗一直是人们研究的方向之一。转基因植物疫苗由于其成本低廉，安全有效，使用方便等优点成为科学家研究的热点。 本研究利用农杆菌侵染法将 8 株 因导入牧草百脉根。通过构建转基因植物表达载体，农杆菌侵染百脉根外植体及组织培养，抗性植株的检测筛选，转基因百脉根植株茎叶浸出物免疫豚鼠的研究，探索目的基因在牧草百脉根的转化、表达及免疫活性。主要进行如下工作： 8 乳鼠毒，连传 2 代乳鼠复壮，提取病毒总 过得目的基因 3C，将目的基因连接克隆载体，测序分析。结果表明， 长2247码 749 个氨基酸，结构蛋白 码733 个氨基酸，2A 编码 16个氨基酸，其中 码 85 个氨基酸，码 218 个氨基酸，码 219 个氨基酸，码 211 个氨基酸，通过分析表明 个结构蛋白及非结构蛋白切割位点比较保守，各结构蛋白之间联接氨基酸分别为 A/D，E/G，Q/T，2末端具有保守的 肽序列。细胞受体结合位点为 的C 全长 639码 213 个氨基酸。 过设计的引物扩增带有特定酶切位点的目的基因，通过酶切、连接将口蹄疫病毒 因、3C 基因串联，构建植物中间表达载体 38验先将基因片段 接到 )质粒，构成 )后再将 接到 体上。通过对构建好的 组质粒进行 定和序列测定，证明中间表达载体构建成功。通过三亲杂交法将重组质粒入农杆菌 101，通过抗性筛选、农杆菌提取质粒 定和序列测定，证明构建成功，与农杆菌中的 粒共同组成植物双元表达载体系统，为下一步的转化奠定基础。 百脉根子叶、子叶柄为转化受体，通过根癌农杆菌 染外植体子叶或子叶柄，经过愈伤、出芽和生根等过程在含有 50 卡那霉素的培养基筛选后，获得抗性植株。对抗性植株进行 测筛选阳性植株，为下一步动物免疫试验提供候选植物材料。 上述检测阳性的植株蛋白提取液，非转基因植株蛋白提取液，同时设转基因空载体对照，活苗阳性对照和弗氏佐剂对照分别免疫豚鼠。首次免疫后第14d、 28d 采血，二免后分别于第 7d、 14d 和 21d 采血， 测表明产生特异性抗体。血清效价最高 164。 关键词：口蹄疫病毒，转基因植物，疫苗，豚鼠，百脉根 is a to of to is to as in to so Up to in on 12A of to as an on as 1. 8 of NA of 12A C NA 12A C 247nt 49 39nt 13 2. 12+） , ） 12NA ）by 35S of by in 3. in in we on of 12in of 0 mg in of by of to 4. in by we of in a A, B, C, D . A: B: D 64. 目 录 第一章 引 言 . 1 口蹄疫概况 . 1 口蹄疫病毒 . 1 牧草百脉根概况 . 1 口蹄疫疫苗研究进展 . 2 灭活疫苗 . 2 弱毒活疫苗 . 3 新型疫苗 . 3 转基因植物疫苗研究概况 . 4 基本原理 . 4 表达载体的构建 . 5 根癌农杆菌. 5 转基因植物疫苗国内外研究进展 . 6 转基因植物疫苗存在问题及发展方向 . 7 转基因植物的生物安全问题 . 8 本研究的目的和意义 . 9 第二章 口蹄疫病毒8 株目的基因. 10 材料与方法 . 10 病毒与乳鼠 . 10 载体及主要试剂 . 10 引物 . 10 病毒增殖 . 10 病毒取 . 11 成 . 11 C 基因的扩增 . 11 . 11 结果与分析 . 13 . 13 重组质粒鉴定 . 13 序列测定 . 14 密码子偏好性分析 . 14 讨论 . 14 第三章 口蹄疫病毒8植物双元表达载体的构建 . 17 材料和方法 . 17 质粒和菌株 . 17 试剂和工具酶 . 17 主要仪器 . 17 ). 17 ). 18 . 19 三亲杂交法将. 19 农杆菌目的基因的. 19 结果与分析 . 19 口蹄疫病毒. 19 讨论 . 20 第四章 口蹄疫病毒免疫原基因 . 23 材料和方法 . 23 种子和转化载体 . 23 主要试剂及仪器 . 23 培养基、激素及抗生素 . 23 种子消毒方法 . 24 百脉根遗传转化 . 24 未转化植株的组织培养 . 25 . 25 . 25 表达蛋白的. 26 结果与分析 . 26 讨论 . 27 第五章 转基因植株的动物免疫试验 . 30 材料和方法 . 30 植物材料和实验动物 . 30 主要试剂 . 30 疫苗的制备及免疫剂量 . 30 动物免疫 . 30 抗体监测 . 31 结果与分析 . 31 抗体的动态变化 . 31 讨论 . 32 第六章 全文总结 . 34 参考文献 . 35 致谢 . 44 作者简历 . 45 . 46 英文缩写 英文名称 中文名称 6性磷酸酶 苄青霉素 哚基磷酸酯 鼠肾细胞系 基对 血清白蛋白 花椰菜花叶病毒 苄青霉素 孢霉素 霍乱肠毒素 B 亚单位 碳酸二乙酯 氧核糖核苷三磷酸 硫苏糖醇 二胺四乙酸 联免疫吸附试验 肝病毒表面抗原 根过氧化物酶 0% 半数感染量 免疫球蛋白 G 卡那霉素 碱基 道尔顿 最低照明度 养基 大肠杆菌肠毒素 B 亚单位 S 培养基 基乙醇 子量 蓝四唑 霉素磷酸转移酶 苷酸 诺沃克病毒衣壳蛋白 密度 苯二胺 放阅读框架 酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 甲基磺酰氟 利福平 r/转速率 转录 狂犬病病毒衣壳蛋白 二烷基磺酸钠 织培养半数感染量 冲液 ,N,N,N四甲基乙二胺 染性胃肠炎病毒 录水平基因沉默 肿瘤诱导质粒 羟甲基氨基甲烷 U 位 杆菌毒性区 第一章 引言 第一章 引 言 口蹄疫概况 口蹄疫(是由口蹄疫病毒(引起的一种严重危害牛羊猪等偶蹄动物的传染病。由于此病流行广，传播速度快，世界动物卫生组织将其列为动物卫生法典中的 A 类疫病之首。中华人民共和国动物传染病防治法也将其列为一类传染病。爆发不仅造成极大的经济损失，而且该病的社会影响也是多方面的。因此早在 1981 年权威的 畜传染病 (美国 1981 年版) 称： 仅是经济性疫病，而且是政治性疫病。鉴于此，世界各国都投入巨资防控该病的流行。 世界上分布很广，除少数发达国家及岛国控制和消灭了本病外，亚洲、非洲和南美一些国家本病流行比较严重(et 000) 。根据 合国粮农组织） 对 166 个成员疫情通报统计，2003报告 病国家和地区 53 个（张永光等，2005 ）。 2000 年以后，世界上多个已消灭了 国家如日本、韩国和蒙古等爆发了口蹄疫，2001 年，多年未发病的英国也未能幸免，造成了巨大的经济损失。这次大流行，使世界各国对口蹄疫有了一个新的认识，加强了对该病的防控和研究力度。 2005年，我国北京、河北等地发生了 永光等，2005 ），国家采取紧急防控措施控制和扑灭疫情。国际上防控口蹄疫的措施主要有两种，一是扑杀，二是疫苗接种。目前，只有在常年无疫病的发达国家采取扑杀政策，疫苗接种是多数国家尤其是发展中国家采取的主要措施。 口蹄疫病毒 口蹄疫病毒( 小口蹄疫病毒属( 共七个血清型，分别为O、A、C、病毒粒子呈球形，衣壳表面相对光滑，不像同科其他病毒有明显的沟(谷(。口蹄疫病毒基因组为正链 8500 个核苷酸组成，基因组的基本结构为：)，基因组的中部是一大的开放阅读框架(f 编码一多聚蛋白( C,1981)（图1。其中组成病毒的四种结构蛋白的基因区为， 依次编码 1A( 1B(1C(1D(裂解的结构蛋白成五聚体单位构成病毒衣壳。2且在病毒蛋白合成过程中，2翻译的复合物中释放已合成的聚蛋白(核糖体仍继续沿病毒下一个密码子跳跃 ，即 2构和功能与细胞的丝氨酸蛋白酶相似，催化多聚蛋白次级裂解（谢庆阁，2004；刘在新，2002） 。 牧草百脉根概况 百脉根又名牛角花、五叶草和乌趾草，学名 英文名 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 多年生豆科百脉根属草本植物，是近二十年从国外引进的优良牧草品种。其茎细叶多，具有较高的营养价值。 开花期粗蛋白质占风干物质的 3 6%。 干物质消化率孕苗期为 盛花期为 适口性好，各类家畜均喜食。百脉根寿命长，能藉种子落地自行繁殖。多单播用作永久放牧地。春天返青早，耐炎热，夏季仍生长良好。每公顷产草量第 1 年16000 21000 公斤， 第二年可达 35520公斤，以结实期为最高。百脉根不仅是果园生草的优良草种，而且在保持水土、改良人工草场、防止国土荒漠化方面都有独特作用；更可贵的是百脉根适应范围广，耐干旱。 图 1口蹄疫病毒基因组 构图 of 口蹄疫疫苗研究进展 疫苗是人类同传染病作斗争的主要武器之一。迄今为止，通过疫苗接种，人类消灭了像天花等一些曾经严重威胁人类生存的疾病。在 苗同样起着举足轻重的作用。二十世纪后半叶绝大多数的欧洲国家和部分南美洲国家通过疫苗的接种完成了对口蹄疫的控制(et 2004)。苗的主要指标是：安全、有效、生产使用方便和价格合理等。为了达到上述指标，世界各国的科研人员进行了不懈的努力，纵观历史上口蹄疫疫苗的发展历程经过了如下几个时期： 灭活疫苗 灭活疫苗是利用常规技术制造的以灭活病毒为抗原的一类疫苗。研制过程大致是通过试验筛选田间毒株作为疫苗种毒，病毒经过大量繁殖，对获得的病毒灭活处理，加佐剂而制成的疫苗。目前，市场上使用的口蹄疫疫苗几乎全部为此类疫苗。灭活疫苗大规模工业化生产是 1962 年英国 验室培育的 代细胞培养 始的。上个世纪 70、80 年代已有悬浮培养生产 价高效的病毒培养技术趋于完善。最初，灭活病毒主要用甲醛，但是鉴于甲醛使病毒的抗原性发生变化从而减弱疫苗免疫力的缺点，后来逐渐采用二乙烯亚胺（为灭活剂，克服了甲醛及其它灭活剂的不稳定、毒性强等缺点。但是，由于生产此种疫苗要用到活毒，疫苗的不完全灭活或从疫苗工厂逃逸的病毒可能引起疫病的爆发，而且制苗需要大规模的设备，还有制剂的乳化保存等诸多环节，制苗成本高。 2 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 弱毒活疫苗 减毒活疫苗在口蹄疫的防治方面，历史上曾经发挥过不小的作用。但实践证明，减毒活疫苗在遗传上不稳定，通过多代可能出现毒力返祖现象。历史上有过多起由于使用活疫苗而爆发口蹄疫的报道。因此，目前世界上已不再研制和使用 疫苗。 新型疫苗 随着分子生物学的发展，包括亚单位疫苗、可饲疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等一系列基因工程疫苗的研究应运而生。 成肽疫苗 合成肽疫苗是应用化学合成技术制备的具有特定抗原活性的一类多肽。理想的多肽疫苗应包括 B 细胞表位和 T 细胞表位。目前认知的关于 表面抗原结构，由于 T 细胞对抗原的识别受 态性的限制，对 T 细胞的表位还未定论。目前主要是根据 然很多报道称多肽疫苗使实验动物得到一定的保护，但其效果不如常规灭活疫苗。由于 细胞，因此，只考虑 组活载体疫苗 病毒活载体疫苗以无病原性、弱毒疫苗株的病毒、细菌等作为携带保护性抗原基因的载体，使动物产生对与外源基因有关的病原微生物侵染的免疫保护，还对载体病原产生保护作用的一类疫苗。现在人们使用的表达外源基因的载体有痘病毒和腺病毒，痘病毒基因组不具有感染性，它在细胞中的复制是在病毒自身的酶及其独特的调节信号下进行的，重组痘病毒表达的蛋白存在加工、修饰及转运过程，和外源病毒的加工过程基本一致，抗原性变异不大； 病毒作为活疫苗在人类历史上有近 30 年的历史，没有发现基因的整合，而且，腺病毒基因组结构和功能研究比较清楚，因此，作为载体使用有一定的应用价值和前景。 酸疫苗 核酸疫苗又称基因疫苗、苗，是将编码病原体免疫保护性抗原基因置于真核表达元件调控下，并将其导入动物机体，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，从而诱导宿主产生对抗原蛋白的免疫应答。核酸疫苗省时省力、持久表达，并且诱发细胞免疫和体液免疫，同时这种疫苗的使用也大大方便了细胞因子的使用。这也说明了 单位疫苗 亚单位疫苗是将编码病原微生物的抗原基因导入受体细菌或细胞，使其在受体中高效表达抗原蛋白，以此抗原蛋白研制的一类疫苗。生产亚单位疫苗的表达系统有原核表达系统和真核表达3 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 系统，在口蹄疫研究方面 d 先后报道克隆的 因在大肠杆菌中得到表达（ G, et C, et 原核表达的蛋白量较高，纯度也好，但是其表达的蛋白免疫原性较差，可能与表达产物不能在原核细胞形成正确的蛋白构像有关。真核系统表达的蛋白在构像形成、分泌和加工都类似于天然蛋白质，具有较高的生物学活性。目前，口蹄疫相关抗原在酵母中得到了表达，具有较好地活性和免疫原性，但是其表达量低。可饲疫苗的表达系统植物，作为一种近年来广泛研究的表达系统，同样具有真核表达系统的特点，不仅如此，由于用其生产的疫苗可直接食用，易获得多价苗，廉价安全，不需特殊的运输和储藏设备而被认为是更为理想的蛋白表达系统（ S. et 995; .,2000）。 转基因植物疫苗研究概况 基本原理 转基因植物疫苗的原理就是将病原微生物或病毒的主要抗原基因通过一定的方法导入植物基因组中，使其在植物中表达合成抗原蛋白，当人或动物摄入这种抗原蛋白后产生免疫保护（1995;999;M.M et 005 ； et 006 ）。将外源基因导入植物细胞基因组中的方法有很多（表 1。经过多年的研究，根癌农杆菌( i 质粒基因转化系统是目前研究最多、理论机理最为清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。迄今，获得的转基因植物 80%是利用根癌农杆菌转化系统将外源基因导入植物基因组中。 根癌农杆菌( 属于 一类革兰氏阴性土壤习居菌，广泛存在于双子叶植物中。农杆菌质粒是一种能实现 移和整合的天然系统。，是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域；，其编码能够实现 移的蛋白。2 24间，两端各有一个含 25复序列的边界序列，是转移识别的唯一信号，在整合过程中左右边界序列之间的 以转移并整合到宿主细胞基因组中。 表 1 转基因植物常用方法比较 of 于 5，编码 工、转移及整合所需的功能蛋白。该区域至少有 64 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 个位点，分别为 些菌种还有 农杆菌侵染植物首先是吸附于植物表面伤口，受伤植物分泌的酚类小分子化合物可以诱导因的表达。物能诱导 粒产生一条新的 链分子，此单链分子从 粒上脱离后，可以与 物 白共价结合，并在 蛋白的帮助下从农杆菌进入植物细胞的染色体中。 表达载体的构建 目前在转基因植物中应用最多的 粒载体转化体系有两类：一类是一元载体系统（共整合载体系统） ，这一类载体系统由一个共整合系统中间表达载体与改造后的受体 农杆菌内，通过同源重组将外源基因整合到修饰过的 成可穿梭的共整合载体， 在这类方法构建困难，整合体形成率低，一般不常用。另一类是双元载体系统，它由两个分别含有 的相容性突变 型 粒（辅助 粒（成，因在两个独立的质粒上，通过反式激活 移到植物细胞基因组内。微型 粒就是含有 界，缺失 因的 粒，为一个广谱质粒。