【毕业学位论文】蓖麻蚕体液胰凝乳蛋白酶抑制剂调查及其基因克隆硕士论文

密 级 ： 论 文 编 号 ：中国农业科学院学 位 论 文蓖 麻 蚕 体 液 胰 凝 乳 蛋 白 酶 抑 制 剂 调 查 及 其 基 因 克 隆 研 究 生 ： 赵 秀 振指 导 教 师 ： 赵 巧 玲 研 究 员申 请 学 位 类 别 ： 农学硕士专 业 ： 特种经济动物饲养研 究 方 向 ： 蚕分子生物学培 养 单 位 ： 中国农业科学院研究生院 中国农业科学院蚕业研究所提 交 日 期 207年 6月， ，207207独 创 性 声 明本人 声 明 所 呈 交 的 论 文 是 我 个 人 在 导 师 指 导 下 进 行 的 研 究 工 作 及 取 得 的 研 究 成果。 尽 我所知， 除 了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论 文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也 不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日关 于 论 文 使 用 授 权 的 声 明本人完全了解中国农业科学院有关保留、 使 用学位论文的规定， 即 ： 中 国农业 科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘， 允 许论文被查阅和借阅， 可 以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、 汇 编学位论文。 同 意中国农业科学院可以用不同方式在 不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保 密 的 学 位 论 文 在 解 密 后 应 遵 守 此 协 议 )论文作者签名： 时间： 年 月 日导师签名： 时间： 年 月 日蛋白 酶抑 制剂 在自 然界 中无 处不 在， 它 们以 多种 形式 存在 于动 物、 植 物甚 至微 生物 的各 种 组织中 ， 主 要 的生 理功 能是 防止 不必 要的 蛋白 水解 。 胰 凝 乳蛋 白酶 抑制 剂 （ 是 丝 氨酸 蛋白 酶 抑制剂 的一 种， 对 维持 昆虫 正常 的生 长发 育起 着重 要的 作用 。 同 时 也是 昆虫 体内 非细 胞免 疫系 统 的重要 组成 部分 。 蓖 麻 蚕是 我国 三大 产丝 昆虫 之一 ， 对 其 体内 胰凝 乳蛋 白酶 抑制 剂的 研究 不但 有 助于蓖 麻蚕 本身 生理 、生 化的 研究 ，也 必将 对其 他野 生鳞 翅目 昆虫 生理 、生 化 的研 究产 生重 要意 义 。本研 究通 过非 变性 聚丙 烯酰 胺凝 胶电 泳和 活性 染色 技术 ， 对 20个蓖 麻蚕 品种 血液 和同 一品 种不 同发 育时期 化 进行 了调 查。 由 于各种 不 同， 引 起迁 移速 度有 快慢， 在碱 性电 泳中 检测到 7种 定 名为 电 点依 次减 小 ；在 酸 性电 泳中 检测到 2种 I，定 名为 中 品 种所 共有 ， 表明 它们 是蓖 麻蚕 生长 发育 所必 需的 。 对 同一 蓖麻蚕 品系 不同 发育 时期 血液 显 示，随 5龄期 发育 ， 有 逐渐 递增 的趋 势。根据家蚕中编码成熟 计引物，利用 8个蓖麻蚕品种的 果在 8个品种中克隆的基因相同，基因序列长为 189测编码 62个氨 基酸 残基 的成 熟蛋 白， 对 蛋白 结构 预测 表明 该蛋 白有 一个 典型的 。 核 苷 酸序 列同源 性比 较显 示， 克隆 的序 列包 含了 编码 家蚕 成熟 核 酸序 列。将蓖 麻蚕 隆 到表 达载体 转化 大肠 杆菌 表达 菌株 ，并 用声裂解后经 导的重组蛋白主要以包涵体的形式存在 ，融 合蛋 白的 分子 量大 约为 15佳 诱导 时间为 8小时 。关 键词： 蓖麻 蚕， 胰凝 乳蛋 白酶 抑制 剂， 非变 性聚 丙烯 酰胺 凝胶 电泳 ，基 因克 I)第一章 绪论 .蛋白酶抑制剂研究背景 .蛋白酶抑制剂的研究进展 .抑 制剂 的分 类 .抑 制剂 的研 究与 应用 .蛋白 酶抑 制剂 在动 物中 的研 究与 应用 .植物 蛋白 酶抑 制剂 的研 究与 应用 .昆虫 蛋白 酶抑 制剂 的研 究与 应用 .胰凝乳蛋白酶抑制剂研究进展 .蛋 白酶 .蛋 白酶 抑制 剂 .蛋 白酶 抑制 剂的 研究 .究的目的和意义 .料和方法 .实验材料 .品 种 .菌 种 .及 试剂 盒 .养 基 .液 和缓 冲溶 液 .验 仪器 和设 备 .常规实验方法 .血 液的 收集 .量 提取 质粒 .内 切酶 反应 .分 离与 回收 . . .粒 的鉴 定 .丙 烯酰 胺凝 胶电 泳 .麻蚕血液中胰凝乳蛋白酶抑制剂多型性研究 .材料与方法 .主 要试 剂 .结果与分析 .血 液中 .不 同发 育阶 段血液 变 化 .与 家蚕 血液 电泳 图谱 比较 .讨论 .麻蚕血液中 .材料和方法 .料 、菌 种、 载体 和试 剂 .脂肪 体总 .引物 设计 .目的 片段 的纯 化和 回收 .重组 载体 的构 建 .序列 分析 .结果与分析 . .果 .隆 .析 .讨论 .麻蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂基因的原核表达 .材料和方法 .料 .法 .重组 表达 载体 的构 建 .重组 蛋白 的诱 导表 达及 表达 形式 的检 测 .表达 条件 的优 化 .结果与分析 .体 的构 建 .白 的诱 导表 达 .达 量与 表达 条件 的关 系 .讨论 .文结论 .蓖麻蚕体液中胰凝乳蛋白酶抑制剂种类的调查 .蛋 白酶 蛋白 酶抑 制剂 的种 类 .期 的调 查 .胰 凝乳 蛋白 酶抑 制剂 的对 比调 查 .胰凝乳蛋白酶抑制剂的基因克隆和序列分析 .克隆基因的表达 . . 简 历 . 缩 略 表英 文 缩 略 表英 文 缩 略 表英 文 缩 略 表英文缩写 英文全称 中文名称水 乙二 胺四 乙酸 二钠硫 代 苷二 烷基 磺酸 纳T 硫 苏糖 醇性 聚丙 烯酰 胺凝 胶电 泳聚 丙烯 酰胺 凝胶 电泳白 酶抑 制剂凝 乳蛋 白酶 抑制 剂蛋 白酶 抑制 剂胰 蛋白 酶抑 制剂豆 蛋白 酶抑 制剂疫 缺陷 病毒转 录 聚合 酶链 式反 应合 酶链 式反 应钟 /分 L 升mL 升h 时光 值补 脱氧 核糖 核酸使 核糖 核酸基 对道 尔顿苄 青霉 素抗 性那 霉素 抗性中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论1第 一 章 第 一 章 第 一 章第 一 章绪 论 绪 论 绪 论绪 酶 （ 几乎 在所 有的 生物 体内 都发 挥着 重要 作用 。 975认 为蛋白 酶不 仅仅 是一 种消 化酶 ， 而 且 在组 织和 器官 中具 有更 多的 功能 ； 他 指 出， 蛋 白 酶对 生物 体 是有益 的， 但 也 存在 着危 险性 。 为 了 避免 这种 危险 的产 生， 机 体 自身 形成 许多 调控 机制 ， 其 中 蛋 白酶抑 制剂 （ 是 研 究的 最多 、 最 广 泛、 最 重 要的 一种 调控 机制 。 蛋 白 酶 抑制剂 与蛋 白酶 一样 ， 是 自 然界 含量 最为 丰富 的蛋 白种 类之 一， 一 般 分子 量都 很小 ， 广 泛分 布在 动物、 植 物甚 至微 生物 中 980。 1936年 936首 次 从 牛 的 胰 脏 ( 分 离 一 种 碱 性 蛋 白 酶 抑 制 因 子 （ 之 后 又从 大豆 中分 离了 一种 胰蛋 白酶 抑制 因子 ， 并 将 其纯 化结 晶， 证 明 了两种 均为 蛋白 质， 由此 揭开 了蛋 白酶 抑制 剂研 究的 序幕 。 抑 制 剂 是 对 蛋 白 水 解 酶 有 抑 制 活 性 的 一 种 小 分 子 蛋 白 质 或 多 肽 ,是蛋 白 酶 的 一 种 基质， 它 能 够与 酶的 活性 部位 和变 构部 位结 合， 形 成 稳定 的复 合体 ， 从 而抑 制酶 的催 化活 性或 阻 止酶原 转化 为有 活性 的酶 。 在 生 物体 内一 系列 的生 理、 病 理 过程 ， 如 对 凝血 、 纤 溶 、 补 体 活化 、 感染、 细 胞 迁移 等方 面发 挥着 关键 性的 调控 作用 ， 同 时 也是 生物 体内 免疫 系统 的重 要组 成部 分。 迄今为 止， 根 据蛋 白酶 抑制 剂所 作用 的酶 的活 性基 团的 不同 及其 氨基 酸序 列的 同源 性， 可 将蛋 白 酶抑制 剂分 为四 类 曲小 华等 ， 2003： 对 胰 蛋白 酶、 胰 凝 乳蛋 白酶 、 弹 性蛋 白酶 有抑 制作 用的 丝 氨酸（ 白酶抑制剂，对木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶有抑制作用的巯基 (白酶抑制剂 ， 对 胶原 酶起 抑制 作用 的金 属 (白 酶抑 制剂 ,抑制 胃蛋 白酶 的酸 性 （ 蛋 白酶抑 制剂 。 其 中 丝氨 酸蛋 白酶 抑制 剂在 自然 界中 分布 的最 为广 泛， 因 此 对其 研究 的也 最多 ， 目 前在其 作用 机理 、氨 基 酸序 列及 衍 射图 谱方 面都 研究 的比 较清 楚。这 类 抑制 剂的 数量 最 多 ，根据 序 列 同 源 性 特 别 是 活 性 中 心 的 位 置 及 半 胱 氨 酸 数 目 和 二 硫 键 所 形 成 的 架 桥 结 构 又 被 分 为至少 16个家族 992。 和 家族研究的最多。 白 酶抑 制剂 是丝 氨酸 蛋白 酶抑 制剂 的主 要类 型， 它的 分子 内通 常含有 7对二 硫键 ， 具 有 两个 相同 或不 同的 蛋白 酶作 用的 活性 中心 。 目 前应 用最 多的 白酶抑制剂基因是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（ 它 有 两 个 抑 制 活性中 心， 可 同时 竞争 性抑 制两 个胰 蛋白 酶分 子。 白 酶抑 制剂 三维 结构 高度 保守 ： 由中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论2一个明显的疏水核心、三对高度保守的二硫键架桥、三链 端螺旋以及一个 袁春 华 ,梁宋 平， 2003。 和 家族 是一 类创 伤诱 导类 型表 达的 蛋白 酶抑 制 剂982。其中 家族包括马铃薯蛋白酶抑制剂 （ ,） ,只有 一个 活性 中心 ，主 要抑 制胰 凝乳 蛋白 酶。 家族 包括 马铃 薯蛋 白酶 抑制 剂 （ ,）和 番 茄蛋 白酶 抑制 剂 （ ,） ,有两 个活 性中 心， 可同 时抑 制胰 蛋白 酶和 胰凝 乳蛋 白酶 。 由于 丝氨 酸蛋 白酶 抑制 剂的 活性 位点 的突 变频 率比 较高 ， 所 以 导致 抑制 剂特 性的 变化 ， 同 时显示 了这 些突 变体 可能 对机 体的 防御 系统 有重 要的 调节 作用 ， 因 此 ， 它 们 在哺 乳动 物、 植 物 和 昆虫中 被研 究的 最多 ，并 且在 许多 领域 得以 开发 和应 用。 酶抑制剂在动物中的研究 与 应用 蛋 白酶抑制剂在动物中的研究 与 应用 蛋 白酶抑制剂在动物中的研究 与 应用蛋 白酶抑制剂在动物中的研究 与 应用高等 动物 的血 液中 存在 多种 蛋白 酶抑 制剂 ，每 100中 ，各 种蛋 白酶 抑制 剂的 总量超过 200980。通常认为，血液中存在的高含量的抑制剂对血液的凝结和其他蛋 白水 解的 形成 进程 如激 素的 产生 、 释 放 和补 体的 定位 具有 重要 的作 用。 广 谱的 蛋白 酶抑 制 剂可抑制体内广泛分布的丝氨酸蛋白酶活性 ,起到调节炎性细胞因子释放、抑制血细胞激活和白细胞跨内皮迁移、减少炎细胞浸润以及组织毒性物质释放等作用 ,表现为多层次的抗炎效应。近年来的 研究 发现 蛋白 酶抑 制剂 能通 过抗 过氧 化反 应、 抗 蛋 白水 解、 保 存 细胞 能量 、 抑 制炎 性介 质 释放等 多种 方式 发挥 功效 ,减轻 器官 损伤 和炎 性损 伤。蛋白 酶抑 制剂 具有 抗炎 抗感 染的 作用 。在 临 床上 应用 最广 的 主要 是胰 蛋白 酶抑 制剂 （ I）， 主要 有： 人 尿胰 蛋白 酶抑 制剂 （ 从 牛 肺 或 牛 胰 脏中提 取的 抑肽 酶 （ 及 人 工合 成的 假黄 酸胍 己苯 酯及 衍生 物。 其 中 许 多对 急性胰 腺炎 起关 键作 用的 酶， 如胰 蛋白 酶、 磷脂 酶 A、胰 凝乳 蛋白 酶及 弹性 蛋白 酶等 ，并 能抑 制溶酶体 酶， 稳定 溶酶 体膜 ，从 而起 到保 护胰 腺的 作用 ； 制 脑血 管通 透性 增高 的作 用， 防止脑 血管 破裂 后迟 发性 脑血 管痉 挛， 预防 肺、 脑缺 血再 灌注 引起 的损 伤 凌贤 龙， 1992。动 物脏器中 提取 的抑 肽酶 是一 特异 性的 蛋白 酶抑 制剂 ， 在 临 床上 用于 治疗 胰腺 炎， 肺 气 肿， 脑 水 肿， 脑 、肺、肠 缺 血再 灌注 损伤 ，心 脏 ，子 宫 等术 后出 血，烧 、烫 伤 外用 及肿 瘤的 辅助 性治 疗 蔡祖 花 ,2000。蛋白 酶抑 制剂 有抗 病毒 感染 的作 用， 可抑 制 、 感染 新细 胞及 复制 所必 需的 蛋白 前体的 裂解 ，阻 止病 毒前 体多 聚蛋 白质 的分 裂， 并干 扰新 的病 毒颗 粒的 成熟 ，使 不 太成熟、 无感 染性 的病 毒颗 粒， 并导 致病 毒繁 殖的 停止 ，阻 止病 毒的 几率 约 99%。同 时由 于病 毒颗 粒仍处 于未 成熟 状态 中，故 可延 迟在 间 的 蔓 延 。 人巨 细胞 病毒 ( 疱 疹 病 毒 ， 为 丝氨 酸蛋 白酶 类， 在 装配 蛋白 产生 和病 毒壳 体成 熟中 有重 要作 用， 所 以 抑 制剂是 最有 前景 的抗 病毒 类药 物。 此外 ，蛋 白酶 抑制 剂还 可阻 止发 生新 的感 染病 灶，延 缓 疾病 的进 展。主 要表 现在 抗肿 瘤方 面 ，如从 人尿 中提 取的 胰蛋 白酶 抑制 剂可 与肿 瘤细 胞上的 合 ， 调 节纤 维蛋 白酶 的活 性， 从而抑 制肿 瘤细 胞的 浸润 和转 移。 抑 肽酶 也可 以作 为肿 瘤的 辅助 治疗 药物 。 巯 基 蛋白 酶抑 制剂 可 对中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论3胃癌 体外 侵袭 转移 具有 抑制 作用 沈洁 等， 1999。在禽 类的 蛋清 中也 存在 蛋白 酶抑 制剂 卵类 粘蛋 白和 卵清 蛋白 酶抑 制剂 。 卵 类 粘蛋 白可 抑制猪 、 羊 和 牛的 胰蛋 白酶 的活 性， 但 对 人的 胰蛋 白酶 活性 无抑 制作 用。 卵 清 蛋白 酶抑 制剂 可抑 制牛和 羊的 胰蛋 白酶 及糜 蛋白 酶的 活性 。它 们 的存 在可 以防 止蛋 白质 的分 解，阻 止 细菌 在蛋 中繁 殖 ，因而 具有 保护 蛋黄 和卵 胚的 作用 。它 们也 是摄 食生 禽蛋 后不 易消 化和 易引 起腹 泻的 原因 。蛋白酶抑制剂的研究 与 应用 植 物蛋白酶抑制剂的研究 与 应用 植 物蛋白酶抑制剂的研究 与 应用植 物蛋白酶抑制剂的研究 与 应用来自植物天然的蛋白酶抑制剂基因本身就是植物对害虫及病原菌侵染的一种天然防御体系。早在 1947年， 些 昆虫 在取 食大 豆后 就不 能正 常生 长、 发 育 。 之后 中 分离 出一 种抑 制物 ， 证 明 是一 种胰 蛋白 酶抑 制剂 ， 这 一 发现 启示 人们 蛋白 酶抑 制剂 可 以作为 一种 新的 抗虫 物质 ，从 此人 们开 始了 对蛋 白酶 抑制 剂抗 虫的 研究 。表 白酶 抑制剂 及其转 基因 叶 片在 正常 情况 下蛋 白酶 抑制 剂的 含量 很低 ， 当 它 受到 虫害 或机 械损 伤时 ， 其 含 量 可在几 小时 内明 显增 加， 主 要是 植物 在受 到虫 害或 病原 菌侵 害时 ， 诱 导 了某 些组 织产 生蛋 白酶 抑 制剂， 这些 抑制 剂能 影响 昆虫 消化 道内 蛋白 酶的 分泌 ，从 而抑 制害 虫对 植物 组织 的食 用 994， 是 一 类特 殊的 组织 创伤 诱导 型表 达蛋 白酶 抑制 剂 ,这种 诱导 表达 贯穿 着植 物的 一生 ， 但是它 的 诱 导 能 力 随 着 植 物 体 的 成 熟 日 益 减 弱 这是 植 物 体 在 生 长 和 繁 殖 之间所寻 求的 一种 平衡 。 植 物 体幼 小时 ， 虫 害 对它 来说 是致 命的 ， 所 以它 只能 合成 大量 的蛋 白酶 抑 制剂， 如 许 多植 物的 种子 、 果 实 、 以 及 一些 块根 、 块 茎 中都 含有 大量 的蛋 白酶 抑制 剂。 对 食性 比 较专一 的食 草性 害虫 而言 ， 由 于 体内 蛋白 酶的 种类 单一 ， 容 易 受到 蛋白 酶抑 制剂 的作 用， 而 杂 食 性害虫，其体内有多种蛋白水解酶，不异受到蛋白酶抑制剂的抑制。 白酶抑制剂影 响昆 虫神 经系 统、 免 疫 系统 和蜕 皮过 程， 因 此 蛋白 酶抑 制剂 是最 有优 势的 作物 抗性 基因 。 自蛋白酶抑制剂 靶标害虫 获得的转基因作物豆丝氨酸蛋白酶抑制剂 ) 鞘翅目、鳞翅目 烟草、马铃薯、番茄、油菜麦胰蛋白酶抑制剂 ) 鳞翅目 烟草瓜胰蛋白酶抑制剂 ) 鳞翅目 烟草豆胰蛋白酶抑制 ) 鞘 翅 目 、 鳞 翅 目 、 直翅目 烟草 、 马 铃 薯 、 番 茄 、 甘 薯 、 水 稻、 油菜菜丝氨酸蛋白酶抑制剂 ) 鳞翅目 烟草、拟南芥稻疏基蛋白酶抑制剂 ) 鞘翅目、同翅目 烟草、油菜豆丝氨酸蛋白酶抑制剂 ) 鳞翅目 烟草、马铃薯铃薯蛋白酶抑制剂 I) 鳞翅目、直翅目 烟草铃薯蛋白酶抑制剂 I) 鳞翅目、直翅目 烟草、水稻豆 鳞翅目 烟草、马铃薯I(番茄蛋白酶抑制剂 I、 I) 鳞翅目 烟草、番茄芋蛋白酶抑制剂 ) 鳞翅目 烟草中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论4从 1987年英国 用 农杆 菌叶 盘转 化法 ，首 次 将豇 豆蛋 白酶 抑制 剂 ( 目前为止，至少有 15种不 同来 源的 蛋白 酶抑 制剂的 。 其 中主 要是 丝氨 酸蛋 白酶 抑制 剂， 因 为 许多昆 虫尤 其是 鳞翅 目昆 虫肠 道中 主要 的消 化蛋 白酶 是丝 氨酸 蛋白 酶。 （表 一 些已 被 克隆的植物蛋白酶抑制剂基因和转基因植物）。实验证明这些转基因植株对昆虫都有明显的抗性。尤其是 且抗 虫谱广，对鳞翅目、鞘翅目、直翅目等几乎所有的昆虫都有杀伤作用。 豆的 为多基因家族，可抑制不同来源的胰蛋白酶的活性，尤其是对鳞翅目有较强的抑制作用 李海燕等， 2000。 巯基蛋白酶抑制剂（）对玉 米根 部害 虫和 根结 线虫 有明 显的 抑制 作用 。蛋白酶抑制剂的研究 与 应用昆虫作为地球上出现最早、种类最多的动物群体，在生态系统中占有重要的位置。在长期的进 化过 程中 ， 它 自 身形 成了 独特 的防 御体 系。 由 于昆 虫体 内没 有高 等动 物所 具有 的淋 巴细 胞 和免疫 球蛋 白， 所 以分 解异 物的 酶， 特 别是 蛋白 酶及 调控 昆虫 体内 蛋白 酶作 用的 蛋白 酶抑 制剂 更 是引起 了人 们的 关注 。 蛋白 酶 是 所 有 昆 虫 体 液 中 最 重 要 的 生 化 酶 类 ， 其 主 要 的 功 能 是 在 昆 虫 的 生 长 、 发 育 、 蜕皮和变 态 过 程 中 参 与 蛋 白 质 的 降 解 和 合 成 ， 而 蛋 白 酶 的 活 性 又 受 蛋 白 酶 抑 制 剂 （ 调 节 。 关于昆虫蛋白酶抑制剂研究的历史比较短 ,最初也只是对昆虫体液中粗提液的蛋白酶抑制因子进行调查 ,后来 才渐 渐用 纯化 的样 品。 1960报 道 了 来 自 蛔 虫 （ 内 的 蛋白 酶抑 制剂 。 森田 等 森田 敏照 ， 吉 川 秀夫 ， 1961在家 蚕幼 虫血 液分 离纯 化了 一种 对 胰凝乳 蛋白 酶和 胰蛋 白酶 有抑 制作 用的 蛋白 酶抑 制剂 。 果 蝇 （ 液中纯化了一种可抑制牛 对胰蛋白 酶 没 有 抑 制 活 性 ， 稳 定性 都很 高 1974,1980。 975实验 证明在 7个不 同目 昆虫 血液 中有 蛋白 酶抑 制剂 的存 在， 这 些 抑制 剂中 多数 对注 射到 血液 中 的灭活 菌有 抑制 作用 ， 并 且 随着 致死 浓度 的增 加它 们对 胰蛋 白酶 、 胰 凝 乳蛋 白酶 、 链 酶蛋 白酶 胞 杆菌 铜绿 素胞 外蛋 白酶 的抗 性也 增强 ， 认 为 这些 抑制 剂可 能是 昆虫 血液 中抗 菌防 御系 统的一 种活 性因 子。 麻蝇 (发 现多 种可 以抑 制血 球半 胱氨 酸蛋 白酶 活性 的 蛋白酶 抑制 因子 族 并 纯化 了其 中的 一种 抑制 因子 ，发 现该 抑制 因子在 3龄幼 虫蜕皮 后及 围蛹 壳完 成之 后， 有 增 加的 倾向 烟 草 天蛾 （ 幼 虫 中也 存 在 多 种 抑 制 剂 ， 两 种 分 子 量 分 别 为 14000000 制 剂 已 经 被 纯 化 998，这两 种抑 制剂 对 性 都很 高 ,酸 序列 与牛 胰蛋 白酶 抑制 剂相 同。990从烟草天蛾幼虫血液中纯化了四种丝氨酸蛋白酶抑制剂，这四种蛋白酶抑制剂 中， 一 种对 猪的 胰肽 酶和 牛的 胰凝 乳蛋 白酶 有抑 制作 用， 另 外两 种对 胰凝 乳蛋 白酶 有特 异 性的抑 制作 用， 另 一种 则对 胰蛋 白酶 的活 性有 特异 的抑 制性 。 这 些 蛋白 酶抑 制剂 都是 昆虫 自身 产 生的调 节性 的抑 制因 子， 对 自身 的酶 有调 节作 用， 将 编码 这些 抑制 剂的 基因 倒入 作物 中也 能阻 遏 昆虫的 正常 的生 理代 谢， 产 生对 害虫 的抗 性。 目 前已 经成 功转 入作 物中 的昆 虫蛋 白酶 抑制 剂基 因 见（表 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论5表 昆虫 的抗虫 基因在 植物 中的表 称糜蛋白酶、 胰乳酶、 是胰腺分泌的 一种蛋白水解酶，具有肽链内切酶的作用 ,能切断蛋白质肽链中酪氨酸、苯丙氨酸的羧基端肽链 ,专一水解芳香族氨基酸 (酪氨酸、色氨酸、亮氨酸 )或大的非极性脂肪族侧链的氨基酸的羧基形成的肽键。胰凝乳蛋白酶在生物体内首先合成无催化活性的胰凝乳蛋白酶原，具有 5对二硫键的单肽链蛋白， 当受到胰蛋白酶的作用后， 这种高活性的 它们再与其他的 使另一分子 的 ， 形成稳定的 A、B、 活性只有 ，酶活性中心的氨基酸残基来自 B、 同，王镜岩，生物化学）。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶都可以消化溶解变性蛋白质， 对 未变性的蛋白质无作用， 因 此能分解炎症部位纤维蛋白的凝结物 ,促进血凝块、 脓性分泌物及坏死组织的溶化分解 ,从而 净化创面 ,促进组织新生和伤口愈合 实用药物手册， 1982，在临床上对抗炎、防止水肿、积血、扭伤水肿、术后浮肿、中耳炎、鼻炎等具有良好的作用。但胰凝乳蛋白酶 比胰 蛋白 酶的能力 强， 毒性 低， 副作 用小 ，所 以在 临床 上具 有更 大的 应用 前景 。 胰蛋 白酶 和胰 凝乳 蛋白 酶都 属于 丝氨 酸蛋 白酶 ， 在 生 物体 的多 种组 织和 器官 中发 挥重 要作 用 ，但如果不正常释放也会导致病理反应， 为 避免这种情况， 有 机体通过积累特异性的蛋白酶 抑制剂来调节这些酶的作用。 蛋 白酶 抑制 剂属 于丝 氨酸 蛋白 酶抑 制剂 ， 它 的 主要 作用 是停 止、 阻 止或 降低 胰凝 乳 蛋白酶 活性 ， 根 据 胰凝 乳蛋 白酶 抑制 剂的 结构 和分 子量 ， 将 其 分为 两大 类： 一 类 是小 分子 量的 蛋 白酶抑制剂，主要有 一类是大分子量的蛋白酶基因产物 靶标害虫 转基因植物烟草天蛾中的反式糜蛋白抑制剂 同翅目 烟草、棉花烟草天蛾中的反式弹性蛋白酶抑制剂 同翅目 苜蓿、棉花、烟草制剂 鳞翅目 马铃薯烟草天蛾的反式胰蛋白酶抑制剂 同翅目 棉花、烟草烟草天蛾的几丁质酶抑制剂 鳞翅目 烟草中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论6抑制 剂， 主要有 小分 子量 的胰 凝乳 蛋白 酶抑 制剂 通常 含有 多个 二硫 键， 结 构非 常稳 定， 通 常是 以单 体或 结 构域的 形式 存在 。 剂 约有 50个氨 基酸 残基 ， 主 要 是对 胰凝 乳蛋 白酶 、 弹 性 蛋白 酶和 枯草杆 菌蛋 白酶 起抑 制作 用 001。 抑 制剂 有两 个独 立非 重叠 的 活性位点，分别对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶有抑制活性，这类抑制剂的核心区域有 18个氨基酸残基是 不可 缺少 的， 序 列中 其余 氨基 酸残 基的 替换 率相 当高 ， 显 示 了它 们在 机体 防御 中有 重要 调 节作 用 。 蛋 白酶 抑制 剂，在 氨 基酸 序列 中分 散有 数个 半胱 氨酸 残基 ， 形 成 几个 二硫 键 ，这种 结构 决定 了它 有较 强的 热稳 定性和 1947。 制 剂主 要是 具有的 丝氨 酸蛋 白酶 抑制 剂，这 种 类型 的抑 制剂 分子 量较 大，一 般为 40 350酸 组成 ， 并 具 有高 度保 守的 三级 结构 ， 具 有 活性的 制 剂有 多种 构象 ， 包 含 了一束 螺旋 和 折叠 形成 多个 结构 域的 交迭 ，活 性中 心环 常位 于肽 链的 通常有 20个氨