【毕业学位论文】鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT-PCR方法的建立与评价硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的 复合实时荧光定量 法的建立与评价 of a of 士 研 究 生：赵建军 指 导 教 师：仇华吉 研究员 申请学位类别：农学硕士 专 业：预防兽医学 研 究 方 向：分子病毒学与免疫学 培 养 单 位：中国农业科学院研究生院 哈尔滨兽医研究所 提交日期 2007 年 6 月 of a of . 007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导 师 签 名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 论文题目 鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的 复合实时荧光定量 法的建立与评价 论文作者 赵建军 指导教师 仇华吉 研究员 培养单位 哈尔滨兽医研究所姓名 职称职务 导师类别 单位 专业 评 阅 人 答辩 主席 刘文周 教 授 博导 东北农业大学 预防兽医学刘文周 教 授 博导 东北农业大学 预防兽医学师东方 教 授 博导 东北农业大学 预防兽医学乔传玲 副研究员 硕导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学刘长军 副研究员 硕导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学张 云 副研究员 硕导 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学答 辩 委 员 答辩时间、地点 2007 年 6 月 13 日于哈尔滨兽医研究所学术报告厅 记 录 刘家森 摘 要 猪瘟（ 由猪瘟病毒（ 起的一种高度接触性传染病，被世界动物卫生组织（列入 病名录（为须申报的（动物传染病。近年来，我国猪瘟的流行和发病特点发生了很大的变化，在临床表现上趋于非典型化，主要表现为隐性带毒和慢性感染，成为影响养猪业发展的一大隐患。 同属的牛病毒性腹泻病毒 1 型（ 牛病毒性腹泻病毒 2 型（、绵羊边界病病毒（和长颈鹿瘟病毒（of 都属于是黄病毒科（瘟病毒属（ 成员，由于瘟病毒属其它成员大都可以感染猪，与 在血清学交叉反应，因此给猪瘟诊断造成一定干扰。此外，猪瘟兔化弱毒疫苗（在我国的大规模应用，为控制猪瘟起到了重要作用，但同时也给传统的诊断方法对 毒感染猪和疫苗接种猪的鉴别诊断带来较大困难。 本研究旨在建立一种复合荧光定量 于过对公布的 34 株 其 5端非编码区设计了一对针对毒株和兔化弱毒疫苗株的特异性解探针，建立了一种能区分 异、重复性好的复合荧光定量别诊断方法。该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群（ 因亚群）的 106别可检测到初始模板中 （野毒）或 （弱毒）拷贝的病毒与本实验室建立的复合式 敏感性相近，二者对 152 份不同样品（包括细胞培养物和临床现地样品）检测阳性符合率分别为 野毒） 和 100%（兔化弱毒疫苗）。应用复合荧光定量 06 份现地样品检测发现， 32/106）。 应用本方法对人工感染 106 14示了时发现，人工感染猪在感染后第2 天在其全血中就可检测到病毒而同居感染猪在出现猪瘟临床症状前 34 应用本方法对 8 份猪瘟兔化细胞疫苗原液效价的检测，证实本方法与兔体反应热法在疫苗效价测定上具有良好的相关性，初步确定细胞疫苗样品中病毒含量为 07拷贝/当于 5104 上时才可以用于制苗。 本方法可以及早对猪瘟爆发做出准确快速诊断，防止疫情蔓延；可以将 毒感染猪迅速从免疫猪群中筛查出来并予以清除，有利于猪瘟的净化和无猪瘟疫区的建立；同时本方法还可辅助传统的兔体定型热反应用于猪瘟疫苗效价估测、病机制研究以及猪瘟疫苗免疫攻毒保护效力评价。 关键词：猪瘟病毒，猪瘟兔化弱毒疫苗，复合荧光定量 针，鉴别诊断I is a of In a in of in or in ( of to be It is to by to On it to is to a of of 4 of in of of in no to of of of 2.2 .3 an 0601L of by of to 1.8 of a CR of (00% ( 52 06 ( of by To in of 06 or by 4 to NA in of as NA in to of is an in I NA by It 07NA 104 be By be to a be in 目 录 第一章 绪 论 .瘟和猪瘟病毒概述 . 1 猪瘟 . 1 猪瘟病毒及其基因组结构 . 1 猪瘟病毒的编码蛋白及其功能 . 2 猪瘟病毒的遗传分型 . 5 猪瘟兔化弱毒疫苗 . 6 光定量 . 6 荧光定量术的原理 . 7 荧光定量术的两种定量形式 . 7 荧光定量术的种类 . 8 荧光定量术在动物疾病检测中的应用 . 9 瘟诊断方法研究现状 . 9 病原学检测 . 9 血清学检测 . 10 间接免疫荧光试验 . 11 间接血凝试验 . 11 分子诊断 . 12 鉴别 诊断 . 14 研究的背景与目的 . 15 第二章 鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的复合荧光定量 . 16 料与方法 . 17 毒株、细胞与质粒 . 17 主要实验仪器及试剂 . 17 引物和探针 . 18 病毒 . 18 复合荧光定量性标准品 . 20 常规. 20 复合荧光定量应条件的优化 . 20 特异性试验 . 21 敏感性试验 . 21 复性试验 . 22 合荧光定量复合符合率试验 . 23 毒分离试验 . 22 合荧光定量现地样品的检测和种系发生分析 . 22 果 . 23 . 23 合荧光定量应参数的优化结果及标准曲线的建立 . 23 合荧光定量特异性 . 26 合荧光定量敏感性 . 26 合荧光定量重复性 . 26 合荧光定量复合符合率 . 27 毒阳性样品的病毒分离验证 . 27 合荧光定量现地样品的检测和种系发生分析 . 28 论 . 30 第三章 复合荧光定量 . 32 料与方法 . 33 验动物及病毒 . 33 器和试剂 . 33 验动物的人工感染 . 33 血中病毒提取和合成 . 33 工感染猪全血中猪瘟病毒的检测 . 33 染猪各组织中猪瘟病毒的检测 . 33 果 . 34 工感染猪临床表现和体温检测 . 34 工感染猪全血中猪瘟病毒的检测 . 34 瘟病毒在感染猪体内的复制动态 . 35 瘟病毒在感染猪各组织中的分布 . 36 论 . 36 第四章 应用复合荧光定量 . 38 料与方法 . 39 苗与实验动物 . 39 剂和仪器 . 39 体定型热法测定疫苗效价 . 病毒 . 猪瘟兔化弱毒疫苗病毒度的检测 .果 . 猪瘟细胞苗的兔体热反应结 果 . 39 合荧光定量量检测结果 . 40 论 . 41 第五章 结 论 . 43 参考文献 . 44 致 谢 . 51 作者简历 . 52V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 羊边界病病毒 病毒性腹泻病毒 瘟 瘟病毒 到阈值的循环数 碳酸二乙酯 联免疫吸附试验 光定量 og 猪瘟兔化弱毒 接免疫荧光试验 疫过氧化物酶单层试验 道尔顿 放读码框 酸盐缓冲溶液 PK 肾细胞 制性片段多态性分析 数兔体感染剂量 转录套式聚合酶链式反应 转录聚合酶链式反应 基罗丹明 数组织细胞感染量 ,2,7氯基荧光素 翻译区 VI 毒分离 国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 第一章 绪 论 瘟和猪瘟病毒概述 瘟 猪瘟（ 是由猪瘟病毒（ 起猪的一种以高热稽留、出血、梗死、坏死和高死亡率为主要特征的高度接触性传染病（et 2005）。世界动物卫生组织（将其列入 病名录（为须申报的（动物传染病之一，我国将其列为一类传染病。 据世界粮农组织世界动物卫生组织世界卫生组织（版的动物卫生年鉴 （ 1992）公布，全世界有44 个国家和地区存在猪瘟，主要分布在南美、欧洲和远东的一些国家和地区。截止到1976年，阿尔巴尼亚、保加利亚等12 个国家宣布消灭了猪瘟。到1992年底又有美国、日本等9 个国家宣布为无猪瘟国家，此外还有新西兰、澳大利亚和斯堪的纳维亚半岛的国家也相继宣布消灭了猪瘟。目前该病主要在亚洲、欧洲、非洲、美洲的国家与地区流行。在我国，当前各省市均有猪瘟的流行，每年因猪瘟死亡的约占病死猪的1/3以上（杜念兴，1998 ）。 猪瘟具有高度接触传染性，发病率、死亡率高，流行广泛，给养猪业造成了巨大的经济损失。在荷兰仅 1983 和 1984 年度为控制猪瘟的直接开支就为 荷兰盾。面对如此大的经济损失，世界各国纷纷开始制定和执行猪瘟防制和根除计划，在英国 1963 1966 三年半时间内为此耗资1200 万英镑，宣布为无猪瘟国家；美国 19621978 年为根除猪瘟花费 美元；比利时 1990年爆发猪瘟销毁猪只直接经济损失达 美元。 瘟病毒及其基因组结构 根据最新的第八次国际病毒分类委员会报告（et ， 2004）：猪瘟病毒（牛病毒性腹泻病毒1 型（，、牛病毒性腹泻病毒2 型（、绵羊边界病病毒（ 长颈鹿瘟病毒（of 成了黄病毒科瘟病毒属5 个确定的成员。 et 1996 ；et ，1996 ；et 1996 ），5 端无帽子结构，3 端也没有多聚腺苷酸（ ）尾。含有一个大的开放性读码框（ ，由其编码一条约3898 个氨基酸的多聚蛋白，在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下，多聚蛋白在翻译和翻译后加工过程中形成12 种成熟的病毒蛋白，在聚蛋白上从N 端到C 端的顺序依次为： C、 0 ）、 图1表1 ，其中 C、 复制是必不可少的（et ，1989；et ， 1990）。 编码构蛋白的基因主要定位于基因组5 端 1/3部分，包括核衣壳蛋白，C ）和3- 1 - 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 种囊膜糖蛋白（： 8 ）、 El（和 E2（。 8种非结构蛋白（，除 码其他非结构蛋白的序列定位于端 2/3部分（et ，1996；1996 ）。大多数非结构蛋白的功能目前还不是很清楚。 病毒基因组制和病毒蛋白表达的主要调控区。 5et ， 1990；et ，1995 ；et ， 1994），而3 能含有起始基因组成的启动子、增强子等顺式作用元件。 通过测定 种结构糖蛋白的N 端，确定1 、N 端分别位于氨基酸残基构蛋白的加工是由宿主细胞的信号酶介导的，蛋白酶首先在核衣壳蛋白 后在 后2。在最后这三种囊膜糖蛋白通过分子内或分子间二硫键形成复合物（et ，1998 ）。两侧的非翻译区（，存在一段17个核苷酸的互补序列，在内是非常保守的。在5 码子和一个高度结构化的核糖体进入位点（。 其 5边界位于核苷酸2866间，这些核苷酸形成一个茎环结构（发卡B ），该结构可能对于活性十分重要（et ，1997 ）。 图 1因组结构示意图 1 猪瘟病毒的编码蛋白及其功能 ，此 98个氨基酸残基，分子量约438进一